Zeinab Fadaie

Chapter 7

Inherited retinal diseases (IRDs) are a group of rare genetic disorders that show a high degree of clinical and genetical heterogeneity and together account for ~2 million affected individuals worldwide. In recent years, with the introduction of new sequencing technologies, novel disease-associated genes and many pathogenic variants have been identified. However, much remains to be elucidated about these genetic diseases with regard to the molecular pathogenesis, the missing heritability and large variation in clinical presentation. This knowledge is important for an accurate counselling of patients and their families for their disease progression, and potential family planning. Moreover, an increase of knowledge and novel insights will create a window of opportunity for the development and implementation of therapeutic approaches. The aim of this thesis was to utilize different state-of-art technologies to provide a molecular diagnosis for different cases with an IRD. We employed several genotyping methods such as whole exome sequencing (WES), whole genome sequencing (WGS), Bionano optical genome mapping, and PacBio ‘single molecule real-time’ sequencing to detect single nucleotide variants as well as structural variants (SVs). Special attention was given to the functional characterization of non-coding variants, in particular those that are predicted to affect the splicing process. In vitro midigene splice assays were carried out in HEK293T cells to identify the splice defects. This combination of extensive genotyping and functional analyses allowed us to provide a genetic diagnosis for a portion of unsolved cases.

Chapter 1 provides a general introduction and is subdivided into three sections. Chapter 1.1 describes the background on visual perception, the structure of the eye and retina, the basics of retinal imaging and other clinical functional assessment technologies. Chapter 1.2 focuses on the genetics of IRDs by describing different molecular diagnostic approaches from coding to non-coding DNA sequencing methods. Additionally, it emphasizes the importance of different databases which are essential for variant classification as well as sharing information of newly identified variants. Chapter 1.3 describes the aim and outline of this thesis.

Chapter 2 discusses a comprehensive guideline of different technologies that were applied from the early 90s until now in IRD and hearing loss research to identify novel disease-associated genes and/or provide a definitive molecular diagnosis. Special attention was given to the third-generation sequencing technologies and their impact on the genetic diagnostic success rate for these two inherited sensory diseases. Moreover, the challenges and importance of variant interpretation in the clinical application were discussed. Finally, the future perspective on the application of optical genome mapping and multi-omics approaches were described as novel methodologies to increase the genetic diagnostic success rate in IRDs and inherited hearing loss.

In Chapter 3, we provide details of four studies that describe the functional analysis of non-coding variants in patients suffering from different IRDs. Chapter 3.1 describes the in vitro functional analysis of 19 non-coding variants in ABCA4 implicated in Stargardt disease. Three novel and 16 previously published rare non-canonical splice site and deep-intronic ABCA4 variants were selected upon splice site predictions, i.e. the disruption of canonical splice sites of ABCA4 exons or the activation of cryptic splice sites in intronic sequence (i.e. pseudoexon insertion), as well as the assessment of conserved motifs such as exonic splice enhancers and silencers. We demonstrate the importance of splice site sequences and conserved motifs when selecting the candidate variants. Chapter 3.2 describes the identification of a near-exon aberrant RNA splice site variant (c.718+23G>A) that is present outside the consensus splice site sequence in TULP1. The variant was identified by WES in two siblings with early-onset retinitis pigmentosa in whom the first pathogenic missense variant in TULP1 was previously found. The c.718+23G>A variant does not have a significant effect on the splice donor site of exon 7. However, it disturbs the balance between the enhancer and silencer motifs in this position and thus leads to a splice defect. This chapter highlights the important role of conserved motifs in the splicing processes. The emphasis of Chapter 3.3 is on the effect of variants in cis in the resulting protein function. We described two unrelated families with adult-onset vitelliform macula dystrophy carrying a complex allele in IMPG2 (c.[3023-15T>A,3023G>A]) upon analysis of WES data. The c.3023G>A variant is not only a putative pathogenic missense mutation by itself but acts as a modifier element for c.3023-15T>A as well by enhancing its splice defect. In both families, individuals carrying this complex allele in a heterozygous manner did not always develop macular dystrophy which highlights the importance of other genetic and environmental factors that contribute to this disease. Chapter 3.4 sheds light on the pathogenic role of a branchpoint variant (c.592-21A>T) in BBS1 in four unrelated families with non-syndromic retinitis pigmentosa, who carried c.1169T>G, the most frequent variant in BBS1, in the other allele. The branchpoint variant was identified through WGS analysis and its complex splice defect was revealed using in vitro midigene splice assays. This chapter characterizes the first pathogenic branchpoint variant reported in IRDs.

Chapter 4 describes a comprehensive study in which 100 individuals with different IRDs were assessed using WGS-based sequence analysis. The probands were previously screened by WES or targeted sequencing approaches and were genetically unsolved. The WGS analysis was performed with special attention to the non-coding variants and the putative causal variants were investigated by in vitro functional assays to prove the pathogenicity. We provide a molecular diagnosis for 27% of the pre-screened cases and suggest employing improved sequencing technologies and variant interpretation to increase the diagnostics yield for IRDs.

Chapter 5 illustrates the implementation of a novel strategy for identification of the genetic defect in IRDs with a strong genotype-phenotype correlation. In a family with choroideremia, previous RNA analysis of an affected proband showed CHM exon 12 skipping, but the underlying DNA defect remained elusive for 18 years. Using optical genome mapping and long-read WGS, an inverted duplication in CHM was identified. We provided a model that demonstrates the origin of the SV through fork stalling and a template switching/microhomology-mediated break-induced replication mechanism. Additionally, we speculated on the mechanism of the splice defect and proposed an altered RNA secondary structure that disrupted the splicing of exon 12. This chapter emphasizes the great opportunities of optical genome mapping and long-read WGS to unravel the hidden SVs in unsolved cases as well as the underappreciated role of an altered RNA secondary structure as a disease mechanism.

Finally, Chapter 6 provides a general discussion of the main findings in this thesis and their implications towards an improved diagnosis of IRDs. The application of different sequencing technologies and their advantages and disadvantages are explained. The importance of branchpoint variants, complex alleles, and variants which affect the RNA secondary structure were discussed. Additionally, the need of accurate splicing tools was explained by comparing different prediction algorithms and highlighting their importance in in vitro functional splice assays. Finally, potential reasons for missing pathogenic variants in the studied cohort were discussed, and it was postulated that application of long-read sequencing will be an important technology in the future of IRDs and other genetic conditions. Moreover, the different cellular systems for in vitro functional analysis can shed light on the currently missed causes of IRDs in the future.

Samenvatting

Chapter 7

Erfelijke netvliesaandoeningen (‘inherited retinal diseases - IRDs’) zijn een groep zeldzame genetische aandoeningen die een hoge mate van klinische en genetische heterogeniteit vertonen. Het betreft ~2 miljoen aangedane individuen wereldwijd. Met behulp van nieuwe sequentietechnologieën zijn er in de afgelopen jaren nieuwe ziekte gerelateerde genen en vele pathogene varianten geïdentificeerd. Er moet echter nog veel worden opgehelderd met betrekking tot de moleculaire pathogenese, de ontbrekende erfelijkheid en de grote variatie in klinische presentatie bij IRDs. Deze kennis is belangrijk voor een nauwkeurige begeleiding van patiënten en hun families met betrekking tot hun ziekteprogressie en eventuele gezinsplanning. Bovendien zal een toename van kennis en nieuwe inzichten kansen creëren voor de ontwikkeling en implementatie van therapieën. Het doel van dit proefschrift was om verschillende geavanceerde technologieën te gebruiken om een moleculaire diagnose te stellen voor IRD-patiënten. We hebben verschillende genotypering methoden gebruikt, zoals whole exome sequencing (WES), whole genome sequencing (WGS), Bionano optische genoom mapping en PacBio 'single molecule real-time' sequencing om zowel enkelvoudige nucleotidevarianten als structurele varianten (SVs) te detecteren. Speciale aandacht werd besteed aan de functionele karakterisering van niet-coderende varianten, in het bijzonder varianten waarvan wordt voorspeld dat ze het splicingproces beïnvloeden. In vitro midigen splice analyses werden uitgevoerd in HEK293T-cellen om de splice defecten te identificeren en karakteriseren. Door deze combinatie van uitgebreide genotypering en functionele analyses konden we een genetische diagnose stellen voor een deel van de onopgeloste gevallen.

Hoofdstuk 1 geeft een algemene inleiding en is onderverdeeld in drie secties. Hoofdstuk 1.1 beschrijft de achtergrond over visuele waarneming, de structuur van het oog en het netvlies, de basisprincipes van retinale beeldvorming en andere klinische functionele beoordelingstechnologieën. Hoofdstuk 1.2 richt zich op de genetica van IRDs door verschillende moleculaire diagnostische benaderingen te beschrijven, van alleen coderende tot niet-coderende DNA-sequentiemethoden. Bovendien benadrukken wij het belang van verschillende databases die essentieel zijn voor de classificatie van varianten en voor het delen van informatie over nieuw geïdentificeerde varianten. Hoofdstuk 1.3 beschrijft het doel en de opzet van dit proefschrift.

Hoofdstuk 2 bespreekt een uitgebreide richtlijn van verschillende technologieën die vanaf de vroege jaren 90 tot nu werden toegepast in IRD-onderzoek en onderzoek naar gehoorverlies, om nieuwe ziekte gerelateerde genen te identificeren en/of een definitieve moleculaire diagnose te stellen. Speciale aandacht werd besteed aan de derde generatie sequentietechnologieën en hun impact op het succespercentage van genetische diagnostiek voor deze twee erfelijke sensorische aandoeningen. Bovendien werden de uitdagingen en het belang van variantinterpretatie in de klinische toepassing besproken. Tenslotte werd het toekomstperspectief op de toepassing van optische genoom mapping en multi-omics-benaderingen beschreven als nieuwe benaderingen om het succespercentage van genetische diagnostiek bij IRDs en erfelijk gehoorverlies te verhogen.

Hoofdstuk 3 omvat vier studies met functionele analyse van niet-coderende varianten bij patiënten met verschillende IRDs. Hoofdstuk 3.1 beschrijft de in vitro functionele analyse van 19 niet-coderende varianten in ABCA4 die betrokken zijn bij de ziekte van Stargardt. Drie nieuwe en 16 eerder gepubliceerde zeldzame varianten die zich in de consensus sequenties bevinden van de splice sites en diep-intronische ABCA4-varianten werden geselecteerd op basis van voorspellingen van veranderingen van splice site sterktes, d.w.z. de verstoring van bestaande splice sites van ABCA4-exonen of de activering van cryptische splice sites in intronische sequentie (d.w.z. pseudoexon-inserties). Daarnaast werden er voorspellingen gedaan over sequentie-elementen die exon inclusie of exon exclusie kunnen versterken of verzwakken. Gebruik makend van deze voorspellingen konden we kandidaat varianten beter selecteren. Hoofdstuk 3.2 beschrijft de identificatie van een RNA splice site variant (c.718+23G>A) die aanwezig is buiten de consensus splice site sequentie in TULP1. De variant werd door WES geïdentificeerd bij een broer en zus met vroegoptredende retinitis pigmentosa bij wie eerder een andere pathogene missense variant in TULP1 werd gevonden. De c.718+23G>A variant heeft geen significant effect op de splice donor site van exon 7. Echter de balans wordt verstoord tussen de versterker en verzwakker motieven in deze positie en leidt tot een splice defect. Dit hoofdstuk belicht de belangrijke rol van geconserveerde motieven in de splicing processen. De nadruk in hoofdstuk 3.3 ligt op het effect van varianten in cis op de resulterende eiwitfunctie. We beschreven twee niet-verwante families met vitelliforme macula-dystrofie met ziekte aanvang op volwassen leeftijd die een complex allel in IMPG2 dragen (c.[3023-15T>A,3023G>A]) na analyse van WES-gegevens. De c.3023G>A variant is niet alleen een mogelijke pathogene missense mutatie op zichzelf, maar fungeert ook als een modificerend element voor c.3023-15T>A door het splice defect als gevolg van deze variant te versterken. In beide families ontwikkelden individuen die dit complexe allel op een heterozygote manier droegen niet altijd een macula dystrofie, wat het belang onderstreept van andere genetische en omgevingsfactoren die bijdragen aan deze ziekte. Hoofdstuk 3.4 werpt licht op de pathogene rol van een ‘branchpoint’ variant (c.592-21A>T) in BBS1 in vier niet-verwante families met niet-syndromale retinitis pigmentosa die c.1169T>G droegen, de meest voorkomende variant in BBS1, in de andere allel. De branchpoint-variant werd geïdentificeerd door middel van WGS-analyse en het complexe splice defect werd gevonden met behulp van in vitro midigene splice-assays. In dit hoofdstuk wordt de eerste pathogene branchpoint variant beschreven die in IRDs wordt gerapporteerd.

Hoofdstuk 4 beschrijft een uitgebreide studie waarin 100 individuen met verschillende IRDs werden bestudeerd m.b.v. WGS. De index patiënten waren eerder gescreend via WES of gen-specifieke sequencing en waren genetisch nog niet opgelost. De WGS-analyse werd uitgevoerd met speciale aandacht voor de niet-coderende varianten en de mogelijk causale varianten werden onderzocht m.b.v. in vitro functionele assays om de pathogeniciteit te bewijzen. We bieden een moleculaire diagnose voor 27% van de vooraf gescreende gevallen en suggereren een verdere verbetering van sequentietechnologieën en interpretatie van varianten om de diagnostische opbrengst voor IRDs te verhogen.

Hoofdstuk 5 illustreert de implementatie van een nieuwe strategie voor de identificatie van het genetisch defect in IRDs met een sterke correlatie tussen genotype en fenotype. In een familie met choroideremie toonde eerdere RNA-analyse van een patiënt het overslaan van CHM exon 12, maar het onderliggende DNA-defect bleef 18 jaar lang ongrijpbaar. Met behulp van optische genoom mapping en WGS waarin lange DNA-moleculen werden geanalyseerd, werd een omgekeerde duplicatie in CHM geïdentificeerd. We hebben een model verstrekt dat de oorsprong van de SV aantoont door middel van ‘fork stalling and a template switching/microhomology-mediated break-induced replication mechanism’. Daarnaast speculeerden we over het mechanisme van het splice defect en stelden we de vorming voor van een secundaire RNA-structuur die de splicing van exon 12 verstoorde. Dit hoofdstuk benadrukt de grote mogelijkheden van optische genoom mapping en lange moleculen WGS om de verborgen SVs in onopgeloste gevallen te ontrafelen evenals de ondergewaardeerde rol van veranderingen van de secundaire structuur van RNA als ziektemechanisme.

Ten slotte geeft Hoofdstuk 6 een algemene bespreking van de belangrijkste bevindingen in dit proefschrift en hun implicaties voor een verbeterde diagnose van IRDs. De toepassing van verschillende sequentietechnologieën en hun voor en nadelen worden uitgelegd. Het belang van branchpoint varianten, complexe allelen en varianten die de secundaire RNA-structuur beïnvloeden, werd besproken. Bovendien werd de behoefte aan nauwkeurige splicing voorspellingsprogramma’s verklaard door verschillende voorspellingsalgoritmen te vergelijken en hun belang in in vitro functionele splicingtesten te benadrukken. Ten slotte werden mogelijke redenen voor het missen van pathogene varianten in de bestudeerde cohort besproken en werd gepostuleerd dat de toepassing van lange DNA-moleculen sequencing een belangrijke techniek kan zijn voor de toekomst van IRDs en andere genetische aandoeningen. Daarnaast kunnen de verschillende cellulaire systemen voor in vitro functionele analyse lichtschijnen op gemiste oorzaken van IRDs in de toekomst.

Simpele Samenvatting

Chapter 7

We krijgen ons erfelijk materiaal van onze ouders. Dit erfelijk materiaal is het DNA. We krijgen van elke ouder één kopie van het DNA. Maar wat is DNA? DNA is het boek van het leven. Het heeft verschillende hoofdstukken die genen worden genoemd. Het alfabet van dit boek bestaat uit slechts vier letters, namelijk A, T, G en C. Elk gen bevat instructies voor het maken van een eiwit. Eiwitten zijn de bouwstenen van ons lichaam; het zijn de eiwitten die ons eten verteren, die onze botten stevigheid geven, die onze spieren doen bewegen, die onze ogen laten zien etc. Om een eiwit te maken worden de instructies uit het gen eerst gekopieerd in RNA. De RNA kopieën worden gebruikt om eiwitten te maken. Het RNA is een kopie van een gen en bevat dus dezelfde informatie als het gen. Maar niet alle informatie is nodig om een eiwit te maken. Sommige pagina’s bevatten belangrijke instructies om het eiwit te maken. Deze pagina’s worden exonen genoemd. De andere pagina's, die tussen de exonen in liggen, zijn niet belangrijk en worden intronen genoemd. De niet-belangrijke pagina's (intronen) moeten worden verwijderd voordat de RNA kopie gebruikt kan worden om een eiwit te maken. Er zijn verschillende technologieën die het complete levensboek (DNA) kunnen lezen of alleen de belangrijke pagina's ervan (exonen). Met behulp van deze technologieën kunnen we verschillen tussen personen of afwijkingen ontdekken. Sommige afwijkingen zijn niet schadelijk: de instructies kunnen nog steeds gebruikt worden om een functioneel eiwit te maken. Maar andere afwijkingen zijn schadelijk. Deze afwijkingen worden mutaties genoemd. Als deze fouten (mutaties) voorkomen in een van de hoofdstukken, kloppen de instructies voor het maken van een eiwit niet meer. In dit geval worden er niet-werkende eiwitten gemaakt of zelfs helemaal geen eiwitten. De schadelijke fouten (mutaties) kunnen voorkomen in de hoofdstukken (genen) die blindheid kunnen verooraken. In mijn promotieproject gebruikten we verschillende technologieën en probeerden we deze schadelijke fouten te vinden in oog-gerelateerde genen. Bovendien wilden we begrijpen hoe de instructies voor het maken van eiwitten door de fouten wordt veranderd.

Deze schadelijke fouten kunnen voorkomen op de belangrijke pagina's (exonen). Maar ze kunnen ook voorkomen op de niet-belangrijke pagina's (intronen) die verwijderd moeten worden. Mijn promotieproject richt zich op de fouten in de niet-belangrijke pagina's. Het is niet altijd gemakkelijk om te interpreteren hoe de instructies voor het maken van eiwitten zullen veranderen door de fouten in de niet-belangrijke pagina's. Er kan bijvoorbeeld een schadelijke fout in het midden van een niet-belangrijke pagina staan die ervoor zorgt dat er een extra stap wordt toegevoegd aan de bouwinstructies voor een eiwit. Op deze manier bevat de kopie (RNA) te veel informatie. De eiwitfabriek leest ook de extra informatie en resulteert in misvormde eiwitten of helemaal geen eiwitten. Het gevolg is dat dat specifieke eiwit zijn werk niet kan doen. We hebben verschillende voorbeelden van deze fouten gevonden, zoals is te lezen in hoofdstuk 3.1 en hoofdstuk 4 van mijn proefschrift. Soms bevinden de schadelijke fouten zich op de overgang van een belangrijke pagina (exon) naar een niet-belangrijke pagina (intron). De gevolgen van deze schadelijke fouten zijn verschillend. Soms verwijderen ze (een deel van) een belangrijke pagina. Hierdoor kan er geen gezond eiwit worden gemaakt. Andere keren blijft een deel van de niet-belangrijke pagina op de belangrijke pagina staan en wordt niet verwijderd. Dat leidt uiteindelijk ook tot verkeerde instructies en een niet-functioneel eiwit. In mijn proefschrift vonden we verschillende van deze schadelijke fouten, zoals is te lezen in Hoofdstuk 3 en Hoofdstuk 4.

De schadelijke fouten bestaan niet altijd uit slechts één letter. Ze kunnen ook groter zijn. In dat geval zijn er meerdere pagina's of hoofdstukken gekopieerd of verwijderd. Verder kan de volgorde van de pagina’s of de hoofdstukken veranderd zijn. Deze fouten leiden er eveneens toe dat de instructies voor het maken van eiwitten niet meer kloppen en daardoor worden er geen functionele eiwitten meer gemaakt. In Hoofdstuk 4 en Hoofdstuk 5 van mijn proefschrift hebben we enkele van deze grote schadelijke fouten beschreven. Tijdens mijn promotieonderzoek hebben we veel schadelijke kleine en grote fouten ontdekt die de instructies voor het maken van eiwitten beïnvloeden. Alleen als we weten hoe de instructies zijn veranderd, kunnen we een manier vinden om de fouten te herstellen, zodat er weer een functioneel eiwit gemaakt kan worden. Mijn onderzoek is een eerste stap in dit proces en maakt het op termijn mogelijk om patiënten met een erfelijke vorm van slechtziendheid te kunnen helpen.

هدﺎﺳ نﺎﺑز ﻪﺑ ﯽﺳرﺎﻓ ﻪﺻﻼﺧ

Chapter 7

ﻪﺨﺴﻧ ﮏﯾ ردﺎﻣ ﺎﯾ رﺪﭘ ﺮﻫ زا ﺎﻣ و دﻮﺷ ﯽﻣ هﺪﯿﻣﺎﻧ DNA ﯽﺛرا هدﺎﻣ ﻦﯾا . ﻢﯾﺮﺑ ﯽﻣ ثرا ﻪﺑ دﻮﺧ نارﺪﭘ و ناردﺎﻣ زا ار دﻮﺧ ﯽﺘﺛارو داﻮﻣ ﺎﻣ هﺪﯿﻣﺎﻧ نژ ﻪﮐ دراد ﯽﻔﻠﺘﺨﻣ یﺎﻫ ﻞﺼﻓ بﺎﺘﮐ ﻦﯾا .ﺖﺳا دﺮﻓ ﺮﻫ ﯽﮔﺪﻧز بﺎﺘﮐ DNA ؟ﺖﺴﯿﭼ DNA ﺎﻣا .ﻢﯿﻨﮐ ﯽﻣ ﺖﻓﺎﯾرد DNA زا نﺎﯿﺑ ار صﺎﺧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ نﺎﺘﺳ اد ﮏﯾ (نژ) ﻞﺼﻓ ﺮﻫ .ﺖﺳا هﺪﺷ ﻞﯿﮑﺸﺗ G و C ، T ، A فﺮﺣ رﺎﻬﭼ زا ﻂﻘﻓ بﺎﺘﮐ ﻦﯾا یﺎﺒﻔﻟا . ﺪﻧﻮﺷ ﯽﻣ لﻮﻠﺳ ﻪﺘﺴﻫ رد DNA : دراد دﻮﺟو ﻞﮑﺸﻣ ﮏﯾ ، رﺎﮐ ﻦﯾا مﺎﺠﻧا یاﺮﺑ لﺎﺣ ﻦﯾا . ﺎﺑ دور رﺎﮐ ﻪﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺖﺧﺎﺳ یاﺮﺑ ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ﻪﮐ ﺪﻨﮐ ﯽﻣ ﻪﺑ ار دﻮﺧ تﺎﻋﻼﻃا ،دﻮﺷ جرﺎﺧ ﻪﺘﺴﻫ زا ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻤﻧ DNA ﻪﮐ ﺎﺠﻧآ زا . ﺪﻨﺘﺴﻫ ﻪﺘﺴﻫ زا جرﺎﺧ رد ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺖﺧﺎﺳ mﺎﺧ داﻮﻣ ﺎﻣا ﺖﺳا ﻪﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺖﺧﺎﺳ یاﺮﺑ ار تﺎﻋﻼﻃا و ﺪﻨﮐ کﺮﺗ ار ﻪﺘﺴﻫ ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ نﺎﺳر مﺎﯿﭘ ﻦﯾا .ﺪﻫد ﯽﻣ نﺎﺳر مﺎﯿﭘ RNA مﺎﻧ ﻪﺑ یﺮﮕﯾد لﻮﮑﻟﻮﻣ .ﺪﻧﺎﺳﺮﺑ لﻮﻠﺳ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﻪﻧﺎﺧرﺎﮐ رد ﻪﮐ رﻮﻄﻧﺎﻤﻫ . ﺪﻨﺘﺴﯿﻧ یروﺮﺿ تﺎﻋﻼﻃا ﻦﯾا ﻪﻤﻫ ،لﺎﺣ ﻦﯾا . ﺎﺑ ﺪﻨﮐ ﯽﻣ ﺖﻓﺎﯾرد ( نژ ) ﻞﺼﻓ ﺮﻫ ار زا تﺎﻋﻼﻃا ﻪﯿﻠﮐ نﺎﺳر مﺎﯿﭘ RNA نوﺰﮔا ﻪﮐ ﺪﻨﺘﺴﻫ ﻢﻬﻣ رﺎﯿﺴﺑ نﺎﺘﺳاد ﻦﯾا کرد یاﺮﺑ تﺎﺤﻔﺻ زا ﯽﺧﺮﺑ . ﺪﻨﮐ ﯽﻣ نﺎﯿﺑ ار ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ نﺎﺘﺳاد ﮏﯾ ﻞﺼﻓ ﺮﻫ ،ﺪﺷ ﺮﮐذ ﻻﺎﺑ ( نوﺮﺘﻨﯾا ) ﻂﺒﺗﺮﻣﺮﯿﻏ تﺎﺤﻔﺻ . ﺪﻨﯾﻮﮔ ﯽﻣ نوﺮﺘﻨﯾا ﺎﻬﻧآ و ﻪﺑ ﺪﻨﺘﺴﯿﻧ ﻂﺒﺗﺮﻣ نﺎﺘﺳاد ، ﺎﺑ نوﺰﮔا ﻦﯿﺑ رد ،ﺮﮕﯾد تﺎﺤﻔﺻ و ﺪﻧﻮﺷ ﯽﻣ هﺪﯿﻣﺎﻧ . دﻮﺷ ﻪﺘﺧﺎﺳ ﻢﻟﺎﺳ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﮏﯾ ﺎﻬﺘﻧا رد ﺎﺗ ﺪﻧﻮﺷ اﺪﺟ ﻪﺘﺴﻫ زا جرﺎﺧ ﻪﺑ نﺎﺳر مﺎﯿﭘ لﺎﺳرا زا ﻞﺒﻗ ﺪﯾﺎﺑ . ﺎﺑ ﺪﻧاﻮﺨﺑ ار ( ﺎﻫ نوﺰﮔا ) نآ ﻢﻬﻣ تﺎﺤﻔﺻ ﺎﻬﻨﺗ ﺎﯾ ﻞﻣﺎﮐ رﻮﻃ ار ﻪﺑ ( DNA ) ﯽﮔﺪﻧز بﺎﺘﮐ فوﺮﺣ ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ﻪﮐ دراد دﻮﺟو یروﺎﻨﻓ ﻦﯾﺪﻨﭼ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﻪﻧﺎﺧرﺎﮐ و ﺪﻨﺘﺴﯿﻧ روآ نﺎ ز ﯾ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا زا ﯽﺧﺮﺑ . ﺖﻓﺎﯾ ار بﺎﺘﮐ ﻦﯾا رد دﻮﺟﻮﻣ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ناﻮﺗ ﯽﻣ ﺎﻫ یروﺎﻨﻓ ﻦﯾا زا هدﺎﻔﺘﺳا رﺎﯿﺴﺑ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا زا ﯽﺧﺮﺑ ، لﺎﺣ ﻦﯾا . ﺎﺑ دزﺎﺴﺑ ﯽﻤﻟﺎﺳ و بﻮﺧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ nآ و زا ﺪﻧاﻮﺨﺑ ار نﺎﺘﺳاد ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ نﺎﻨﭽﻤﻫ لﻮﻠﺳ رد ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﻦﮑﻤﻣ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﻪﻧﺎﺧرﺎﮐ ، ﺪﺘﻔﯿﺑ قﺎﻔﺗا ﺎﻫ ﻞﺼﻓ زا ﯽﮑﯾ رد ( ﺎﻫ ﺶﻬﺟ ) تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا ﺮﮔا . ﺪﻧﻮﺷ ﯽﻣ هﺪﯿﻣﺎﻧ ﺶﻬﺟ ﻪﮐ ﺪﻨﺘﺴﻫ روآ نﺎ ز ﯾ ﻢﻟﺎﺳﺎﻧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ و ﺎﯾ ﺖﺷاد ﻢﯿﻫاﻮﺨﻧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﭻﯿﻫ ﺎﯾ ﺖﻟﺎﺣ ﻦﯾا رد . ﺪﻧاﻮﺨﺑ ار نآ ﺪﻧاﻮﺘﻧ ًﻼﺻا ﺎﯾ ﺪﻨﮐ ﺮﯿﺒﻌﺗ ﻮﺳ ار ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ نﺎﺘﺳاد ﺖﺳا ﯽﯾﺎﻨﯿﺑﺎﻧ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ﻪﮐ ﺪﻨﻫد خر ﻢﺸﭼ ﻪﺑ طﻮﺑﺮﻣ ی ( ﺎﻫ نژ ﺎﻫ ) ﻞﺼﻓ رد ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ ( ﺎﻫ ﺶﻬﺟ ) تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا . ﺪﺷ ﺪﻫاﻮﺧ ﺪﯿﻟﻮﺗ یﺎﻫ نژ رد ار ( ﺎﻫ ﺶﻬﺟ ) تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا ﻢﯾدﺮﮐ ﯽﻌﺳ و ﻢﯾدﺮﮐ هدﺎﻔﺘﺳا ﯽﻔﻠﺘﺨﻣ یﺎﻫ یروآ ﻦﻓ زا ﺎﻣ ،ﻦﻣ یاﺮﺘﮐد هژوﺮﭘ رد . دﻮﺷ کرد و ﯽﻨﯿﺑ ﺶﯿﭘ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا سﺎﺳا ﺎﻫ ار ﺮﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﻪﺘﻓﺎﯾ ﺮﯿﯿﻐﺗ نﺎﺘﺳاد ﻢﯾدﺮﮐ شﻼﺗ ﺎﻣ ،ﻦﯾا ﺮﺑ هوﻼﻋ . ﻢﯿﻨﮐ اﺪﯿﭘ ﻢﺸﭼ ﻪﺑ طﻮﺑﺮﻣ . ﻢﯿﻨﮐ ﻪﮐ ( ، ﺎﻫ نوﺮﺘﻨﯾا ) ﻂﺒﺗﺮﻣﺮﯿﻏ تﺎﺤﻔﺻ رد دراد نﺎﮑﻣا ﻦﯿﻨﭽﻤﻫ . ﺪﺘﻔﯿﺑ قﺎﻔﺗا ( ﺎﻫ نوﺰﮔا ) ﻢﻬﻣ تﺎﺤﻔﺻ رد تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ نﺎﺘﺳاد کرد و ﺮﯿﺴﻔﺗ . ﺖﺳا ﺰﮐﺮﻤﺘﻣ ﻂﺒﺗﺮﻣ ﺮﯿﻏ تﺎﺤﻔﺻ رد تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا یور ﻦﻣ یاﺮﺘﮐد ی هژوﺮﭘ . ﺪﺘﻔﯿﺑ قﺎﻔﺗا ﺰﯿﻧ ،ﺪﻧﻮﺷ فﺬﺣ ﺪﯾﺎﺑ هﺎﺒﺘﺷا ﮏﯾ ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ ،لﺎﺜﻣ ناﻮﻨﻋ ﻪﺑ . ﺖﺴﯿﻧ نﺎﺳآ ﻪﺸﯿﻤﻫ ﻂﺒﺗﺮﻣ ﺮﯿﻏ تﺎﺤﻔﺻ رد تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا داﺪﺧر ﻞﯿﻟد ﻪﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﻪﺘﻓﺎﯾ ﺮﯿﯿﻐﺗ ﻪﺑ . ﺪﻨﮐ ﻪﻓﺎﺿا ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ نﺎﺘﺳاد ار ﻪﺑ ﯽﻓﺎﺿا ﺖﺳردﺎﻧ تﺎﻋﻼﻃا ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ﻪﮐ ﺪﺷﺎﺑ ﻪﺘﺷاد دﻮﺟو ( نوﺮﺘﻨﯾا ) ﻂﺒﺗﺮﻣ ﺮﯿﻏ ﻪﺤﻔﺻ ﻂﺳو رد نﺎﺘﺳاد ﻦﯾا ﺰﯿﻧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﻪﻧﺎﺧرﺎﮐ . دﻮﺷ ﯽﻤﻧ اﺪﺟ و ﺪﻧﺎﻣ ﯽﻣ ﯽﻗﺎﺑ نﺎﺳر مﺎﯿﭘ رد ﻂﺒﺗﺮﻣ ﺮﯿﻏ ﻪﺤﻔﺻ ﻦﯾا زا ﯽﺸﺨﺑ ،ﺐﯿﺗﺮﺗ ﻦﯾا لﻮﻠﺳ رد صﺎﺧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ nآ ﻪﮐ ﺖﺳا ﻦﯾا ﻪﺠﯿﺘﻧ . ﺪﺳﺮﯿﻤﻧ مﺎﻤﺗا و ﻪﺑ هﺪ ﺷ ﻒﻗﻮﺘﻣ نﺎﺘﺳاد ﻂﺳاوا رد ًﻻﻮﻤﻌﻣ ﻪﮐ ﺪﻧاﻮﺧ ﯽﻣ ار ﻢﻟﺎﺳﺎﻧ 4 ﻞﺼﻓ و ۳.۱ ﻞﺼﻓ رد ار ﺎﻫ nآ سﺎﺳا ﺮﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ nﺎﺘﺳاد ﺮﯿﯿﻐﺗ ﯽﮕﻧﻮﮕﭼ و تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا زا ﻪﻧﻮﻤﻧ ﻦﯾﺪﻨﭼ ﺎﻣ . ﺪﺷ ﺪﻫاﻮﺨﻧ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﺎﻫ . ﻢﯾداد حﺮﺷ ﻪﻣﺎﻧ نﺎﯾﺎﭘ ﻦﯾا توﺎﻔﺘﻣ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا ﺐﻗاﻮﻋ . ﺪﻧراد راﺮﻗ ( نوﺮﺘﻨﯾا ) ﻂﺒﺗﺮﻣﺮﯿﻏ ﻪﺤﻔﺻ و ( نوﺰﮔا ) ﻢﻬﻣ ﻪﺤﻔﺻ یﺎﻫزﺮﻣ رد روآ نﺎ ز ﯾ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ، ﯽﻫﺎﮔ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ نﺎﺘﺳاد زا ﯽﺸﺨﺑ ﻪﺠﯿﺘﻧ رد . ﺪﻨﻨﮐ ﯽﻣ فﺬﺣ ار nآ زا ﯽﺸﺨﺑ ﺎﯾ ﻞﻣﺎﮐ رﻮﻃ ﻪﺑ ار ﻢﻬﻣ ﻪﺤﻔﺻ ﮏﯾ ﺎﻫ nآ ، دراﻮﻣ ﯽﺧﺮﺑ رد . ﺖﺳا ﯽﻣ ﯽﻗﺎﺑ ﻢﻬﻣ ﻪﺤﻔﺻ ﺎﺑ ﻂﺒﺗﺮﻣ ﺮﯿﻏ ﻪﺤﻔﺻ زا ﯽﺸﺨﺑ ،ﺮﮕﯾد ﻊﻗاﻮﻣ رد . دزﺎﺴﺑ ﻢﻟﺎﺳ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﮏﯾ ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻤﻧ ﻪﻧﺎﺧرﺎﮐ و دﻮﺷ ﯽﻣ فﺬﺣ ﻦﯾﺪﻨﭼ ،ﻦﻣ ﻪﻣﺎﻧ نﺎﯾﺎﭘ رد . دﻮﺷ ﯽﻣ ﻢﻟﺎﺳﺎﻧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ و هﺎﺒﺘﺷا nﺎﺘﺳاد ﮏﯾ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﺎﻬﺘﻧا رد ﻦﯿﻨﭽﻤﻫ ﻪﮐ ،دﻮﺷ ﯽﻤﻧ اﺪﺟ nآ و زا ﺪﻧﺎﻣ . ﺖﺳا هﺪﺷ هداد ﺢﯿﺿﻮﺗ و ﯽﺳرﺮﺑ 4 ﻞﺼﻓ 3 و ﻞﺼﻓ رد ﺎﻫ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ nﺎﺘﺳاد ﺮﺑ ﺎﻫ nآ تاﺮﺛا و تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا زا درﻮﻣ و ﻞﺼﻓ ﺎﯾ ﻪﺤﻔﺻ ﻦﯾﺪﻨﭼ ﺮﯿﺜﮑﺗ ﺎﯾ فﺬﺣ ﯽﮔرﺰﺑ ﻪﺑ ﺪﻨﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ﻦﯿﻨﭽﻤﻫ دراﻮﻣ ﻦﯾا . ﺪﻨﺘﺴﻫ ی روآ نﺎ ز ﯾ رﺎﯿﺴﺑ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﺰﯿﻧ ﺎﻫ ﻦﯾا . ﺪﻨﺷﺎﺑ ﺎﻫ ﻞﺼﻓ ﻦﯿﺑ ﯽﺘﺣ ﺎﯾ ﻞﺼﻓ ﮏﯾ رد تﺎﺤﻔﺻ ندﺮﮐ ﺎﺟ ﻪﺑ ﺎﺟ ﺎﯾ . دﻮﺷ رﺎﻤﯿﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ دﻮﺟو ﺎﯾ دﻮﺟو مﺪﻋ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ nﺎﯾﺎﭘ رد ﻪﮐ هدﺮﮐ کرد ار ﺢﯿﺤﺻ nﺎﺘﺳاد ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻤﻧ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ . ﺖﺳا هﺪﺷ هداد ﺢﯿﺿﻮﺗ و ﻒﺸﮐ ﺎﻫ nآ تاﺮﺛا و گرﺰﺑ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻦﯾا زا ﯽﺧﺮﺑ ، ﻦﻣ ﻪﻣﺎﻧ نﺎﯾﺎﭘ 5 ﻞﺼﻓ ﯽﻣ ﺮﯿﺛﺄﺗ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﮏﯾ nﺎﺘﺳاد ﺮﺑ ﻪﮐ ﻢﯿﻨﮐ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ار یرﺎﯿﺴﺑ روآ نﺎ ز ﯾ ﮏﭼﻮﮐ و گرﺰﺑ تﺎﻫﺎﺒﺘﺷا ﻢﯾدﻮﺑ ردﺎﻗ ، ﺎﻣ اﺮﺘﮐد هرود ﯽﻃ رد ﯽﻠﺻا nﺎﺘﺳاد ﻪﺑ nآ نﺪﻧادﺮﮔزﺎﺑ یاﺮﺑ ﯽﻫار لﺎﺒﻧد ﻪﺑ ﻢﯿﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ،ﺖﺳا هدﺮﮐ ﺮﯿﯿﻐﺗ ﻪﻧﻮﮕﭼ nﺎﺘﺳاد ﻢﯿﻧاﺪﺑ ﻪﮐ ﯽﺗرﻮﺻ رد ﺎﻬﻨﺗ . ﺪﻧراﺬﮔ ﺎﺑ nارﺎﻤﯿﺑ ﻪﺑ ﻢﯿﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ﻖﯾﺮﻃ ﻦﯾا زا ﻪﺠﯿﺘﻧ رد . دزﺎﺴﺑ ﻢﻟﺎﺳ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﮏﯾ و ﺪﻧاﻮﺨﺑ ار nآ ﺪﺷﺎﺑ ردﺎﻗ ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﻪﻧﺎﺧرﺎﮐ ﻪﮐ ﻢﯿﺷﺎﺑ . ﻢﯿﻨﮐ ﯽﻧﺎﺳر ﮏﻤﮐ ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﯽﯾﺎﻨﯿﺑﺎﻧ ﺎﯾ ﯽﯾﺎﻨﯿﺑ ﻢﮐ یﺎﻫ یرﺎﻤﯿﺑ