Xanthe Brands

Immunopathologie van “community-acquired” pneumonie

De longen worden continu blootgesteld aan verschillende pathogenen die zich kunnen nestelen in het longweefsel en daar een ontsteking kunnen veroorzaken, een pneumonie. In 2019 werden er wereldwijd 489 miljoen mensen gediagnosticeerd met een pneumonie.

Vooral ouderen (>70 jaar) en kinderen (<5 jaar) lopen een groot risico, en pneumonie is een belangrijke oorzaak van ziekenhuisopnames, morbiditeit en mortaliteit. “Community-acquired pneumonia” (CAP) wordt opgelopen buiten de muren van het ziekenhuis met Streptococcus (S.) pneumoniae, een Gram-positieve bacterie, als meest voorkomende ziekteverwekker. Het afweersysteem zorgt, door middel van lokale afweer van epitheel en myeloide cellen, voor een adequate immuunreactie om zo het pathogeen dat de pneumonie veroorzaakt te klaren. Wanneer het afweersysteem de infectie niet klaart en/of er niet tijdig wordt gestart met adequate antimicrobiële therapie kan dit leiden tot groei van de pathogenen en een invasieve infectie, waarbij de ontstekingsreactie van de gastheer dysfunctioneel reageert met schade aan het eigen lichaam en multiorgaan falen als gevolg, een syndroom dat sepsis wordt genoemd. Om inzicht te krijgen in verschillende mechanisme van het aangeboren afweersysteem tijdens CAP en sepsis door CAP, voerden we ‘The Effect of Leukocyte Dna mEthylation and micRoBIOME’ (ELDER-BIOME) studie uit in twee Nederlandse ziekenhuizen (Amsterdam Universitair Medische Centra, locatie AMC, en BovenIJ ziekenhuis). Van geïncludeerde patiënten en controle personen werd uitgebreide (klinische) data verzameld, eiwit biomarkers bepaald, en RNA expressie profielen en epigenetische veranderingen van monocyten bekeken. Daarnaast hebben we gebruik gemaakt van beschikbare data en patiënt materiaal van de ‘Moleculaire Diagnose en Risico Stratificatie van Sepsis’ (MARS) studie die in 2010-2012 werd uitgevoerd in de Intensive Care van Amsterdam Universitair Medische Centra, locatie AMC, en Universitair Medisch Centrum Utrecht. Met de studies beschreven in dit proefschrift willen we onze huidige kennis over de gastheer response tijdens CAP uitbreiden, wat essentieel is in de zoektocht naar het verbeteren van de diagnostiek, aanvullende behandeling en uiteindelijk de algehele uitkomst van pneumonie. Hoofdstuk 1 is een algemene introductie en verdieping van verschillende onderwerpen in de (patho)fysiologie van CAP en sepsis in aanloop naar de verschillende hoofdstukken. In hoofdstuk 2 onderzochten we de frequentie, presentatie en uitkomst van het “macrophage activation-like syndrome” (MALS), gedefinieerd als plasma ferritine spiegels boven 4420 ng/ml, bij opname op de intensive care van ernstig zieke patiënten met sepsis als gevolg van CAP. Daarnaast keken we naar de associatie van MALS met ontregeling van diverse mechanismes van het aangeboren afweersysteem die een grote rol spelen bij de pathogenese van sepsis. We rapporteren dat 15 van de 153 ernstig zieke patiënten met CAP (9,8%) bij opname een plasma ferritine spiegel boven 4420 ng/ml (CAP-MALS) hadden. CAP-MALS-patiënten hadden een hogere mortaliteit op de intensive care (46,7% versus 12,3% in CAP-controles) en toonden aanwijzingen voor meerdere afwijkingen van het aangeboren afweersysteem in vergelijking met CAP-patiënten zonder MALS, waaronder systemische ontsteking, cytokine productie, endotheelcelactivering en barrièrefunctie, en activatie van het stollingssysteem. Hematologische maligniteiten kwamen vaker voor bij CAP-MALS-patiënten (33,3% versus 5,1% bij CAP-controles). In een aparte analyse waarin patiënten met hematologische maligniteiten werden uitgesloten, was CAP-MALS niet meer geassocieerd met verhoogde mortaliteit, maar de gastheer respons afwijkingen bleven aanwezig. Onze resultaten geven inzicht in de epidemiologie en pathofysiologie van MALS tijdens een ernstige CAP infectie, en kunnen relevant zijn voor de selectie van diegenen die baat kunnen hebben bij specifieke anti-inflammatoire therapie. In hoofdstuk 3 onderzochten we de incidentie en pathofysiologische implicaties van hyperferritinemie bij patiënten met CAP die zijn opgenomen op de reguliere afdelingen van het ziekenhuis. We gebruikten hiervoor twee afkapwaarden: 500 ng/ml (veelal gebruikt in COVID-19 trials met verhoogde plasma ferritine spiegels als inclusiecriterium voor de selectie van patiënten voor ontstekingsremmende therapieën) en 250 ng/ml (referentie waarde in de meeste laboratoria). Plasma ferritine spiegels bij opname waren hoger bij patiënten met CAP (n=174) dan bij controles zonder infectie (n=50). Zesentwintig procent van de patiënten had een plasma ferritine concentratie ≥500 ng/ml; 52% had een plasma ferritine concentratie ≥ 250 ng/ml. Hyperferritinemie was geassocieerd, ongeacht het gebruikte afkapniveau, met verhoogde systemische ontsteking, activatie van neutrofiele granulocyten, cytokine productie, endotheelcelactivering en disfunctie, en stollingsactivatie. Dit werd gemeten aan de hand van de plasma concentraties van 26 biomarkers die een afspiegeling zijn van deze gastheerrespons mechanismen. Deze resultaten suggereren dat hyperferritinemie CAP-patiënten identificeert met afwijkingen in diverse mechanismes van de gastheerrespons. In hoofdstuk 4 testten we de hypothese dat CAP geassocieerd is met immuun suppressie en dat de mate daarvan evenredig is met de mate van het tegelijk optreden van pro-inflammatoire reacties. Met behulp van een combinatie van ex vivo leukocyten stimulatie proeven en metingen van 15 plasma biomarkers die inzicht geven in de activering en/of verstoring van de belangrijkste afweermechanismes van de gastheer, toonden we aan dat leukocyten verkregen van gehospitaliseerde CAP patiënten bij opname een verminderde afgifte van pro-inflammatoire cytokines tonen als reactie op stimulatie met bacteriële agonisten (gelijkend op het fenotype gerapporteerd voor ernstig zieke patiënten met sepsis), ongeacht de aanwezigheid van sepsis. Patiënten van wie de leukocyten de minste tumornecrosefactor (TNF)-α produceerden na stimulatie toonden tegelijkertijd verhoogde plasma concentraties van diverse biomarkers van ontsteking, endotheelcelfunctie en het stollingssysteem. Samengevat suggereren deze gegevens dat immuun suppressie tijdens CAP, zoals gemeten door de verminderde ex vivo cytokine productie capaciteit van leukocyten, voorafgaat aan de mogelijke ontwikkeling van sepsis, en dat dit anti-inflammatoire fenotype gepaard gaat met een verscheidenheid aan systemische pro-inflammatoire reacties. Deze resultaten zijn in tegenspraak met de theorie van twee opeenvolgende fasen in de reactie van de gastheer tijdens sepsis, met hyperinflammatie voorafgaand aan “compensatoire” ontstekingsremmende reacties die resulteren in immuun suppressie. In hoofdstuk 5 trachten we vast te stellen of immuun suppressie, die vaak wordt waargenomen bij ernstig zieke patiënten, geassocieerd is met het tegelijk optreden van systemische hyperinflammatie. Leukocyten van ernstig zieke patiënten, opgenomen op de intensive care, werden gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) en patiënten werden gestratificeerd in vier groepen met toenemende immuun suppressie op basis van kwartielen van LPS-geïnduceerde TNF-α productie. Door gebruik te maken van deze stratificatie in combinatie met het meten van 15 plasma biomarkers die inzicht verschaffen in activatie en/of verstoringen in de belangrijkste gastheerrespons mechanismes die betrokken zijn bij de pathogenese van kritieke ziekte, toonden we aan dat de mate van verminderde TNF-α productie van leukocyten geassocieerd was met versterkte systemische ontstekingsreacties en endotheelcelactivering, verlies van vasculaire integriteit en verhoogde stollingsreacties. Deze gegevens geven aan dat als men patiënten selecteert voor immuun stimulerende therapie op basis van TNF-a-productie capaciteit van leukocyten, men waarschijnlijk ook patiënten selecteert die de sterkste systemische ontstekings- en endotheelcel reacties hebben. Deze kennis kan relevant zijn voor de ontwikkeling van behandeling op maat in de intensive care en de selectie van patiënten voor behandeling met immuun stimulerende middelen. In hoofdstuk 6 probeerden we de moleculaire onderbouwing van het fenomeen van immuun tolerantie in circulerende monocyten van CAP patiënten te ontleden. Hiertoe vergeleken we CD14+ monocyten van CAP patiënten met CD14+ monocyten van controle personen, die qua leeftijd, geslacht en co-morbiditeit overeenkwamen. Patiënten werden tweemaal bemonsterd, eerst tijdens het acute stadium van de ziekte (bij studie-inclusie), en een maand later (herstel). Monocyten werden onderworpen aan ex vivo stimulatie met LPS, RNA-sequencing en DNA-methylatie analyse door middel van “reduced representation bisulfite sequencing” (RRBS). We toonden aan dat de circulerende monocyten van CAP patiënten afgenomen tijdens de acute fase van de ziekte, minder cytokinen produceerden tijdens ex vivo LPS blootstelling, wijzend op immuun tolerantie. De productie van IL-6 was nog steeds verminderd was na een maand follow-up, in tegenstelling tot de productie van TNF-α, IL-1β en IL-10, die genormaliseerd was. Dit suggereert dat cytokine-specifieke voetafdrukken van immuun tolerantie in circulerende monocyten, met name de productie van IL-6, verder reiken dan momenteel wordt aangenomen. Door de integratie van cytokine productie, RNA-sequencing en DNA methylering in een multi-omics-model, hebben we mogelijk een essentiële link ontmaskerd tussen DNA methylering op enhancer elementen en immuun tolerantie wat via transcriptoom-analyse kan worden toegeschreven aan de cholesterol biosynthese. Addendum LIST OF CONTRIBUTING AUTHORS Center for Experimental and Molecular Medicine (CEMM), Amsterdam University Medical Centers, Location AMC, Amsterdam, the Netherlands Joe M Butler; Tjitske SR van Engelen; Bas W Haak; Arjan J Hoogendijk; Augustijn M Klarenbeek; Natasja A Otto; Tom van der Poll; Wanhai Qin; Alex R. Schuurman; Brendon P Scicluna; Hessel Peters Sengers; Fabrice Uhel; Floris MC de Vries; Lonneke A van Vught; W Joost Wiersinga; Maryse A Wiewel Department of Intensive Care, Amsterdam University Medical Centers, Location AMC, Amsterdam, the Netherlands Marcus J. Schultz Department of Intensive Care, University Medical Center Utrecht Olaf L Cremer Department of Internal Medicine, Division of Infectious Diseases, Amsterdam University Medical Centers, Location AMC, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands Jan M Prins Department of Internal Medicine, BovenIJ hospital Amsterdam, the Netherlands Daniël R Faber Department of Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht, Utrecht, the Netherlands Marc J Bonten Department of Radiology and Nuclear Medicine, Amsterdam University Medical Centers, Location AMC, University of Amsterdam, The Netherlands Inge AH van den Berk; Maadrika MNP Kanglie; Jaap Stoker Laboratory of Genome Analysis, Amsterdam University Medical Centers, Location AMC, Amsterdam, the Netherlands Marja E Jakobs Respiratory Medicine and Experimental Immunology, Amsterdam University Medical Centers, Location AMC, Amsterdam, the Netherlands René Lutter