Simon Yauw

Wereldwijd moeten jaarlijks miljoenen mensen een darmoperatie ondergaan vanwege darmkanker of andere darmaandoeningen zoals de ziekte van Crohn, colitis ulcerosa en diverticulitis. Na het verwijderen van het zieke darmdeel worden de overgebleven darmuiteinden vaak weer verbonden middels een darmnaad. Helaas treedt er gemiddeld in 6-14% van de gevallen een naadlekkage op. De gevolgen van deze gevreesde complicatie zijn enorm voor de patiënt omdat het kan resulteren in abcessen, een buikvliesontsteking en zelfs overlijden. Daarnaast is er een grotere kans op terugkeer van de kanker en is de kwaliteit van leven op de lange termijn verminderd. De maatschappelijke impact is groot door een langer ziekteverzuim en een verdubbeling van de kosten als gevolg van meer re-operaties, meer Intensive Care opnames, langere ziekenhuisopnames en een groter aantal heropnames (1, 2). De ernstige gevolgen van naadlekkage zijn in de afgelopen decennia uitgebreid onderzocht, maar helaas heeft dit nog niet geleid tot een duidelijke afname van deze complicatie (3, 4). Een belangrijke reden is dat er nog onvoldoende bekend is over de ontstaanswijze van naadlekkage (3). Belangrijk doel van dit proefschrift is om de kennis van de normale en verstoorde darmnaadgenezing te vergroten om daarmee de incidentie en de gevolgen van naadlekkage te kunnen verminderen. We hebben specifiek gekeken naar de schadelijke effecten van een veel gebruikte perioperatieve pijnstiller (i.e. diclofenac) op dunne- en dikkedarmnaden.

Fysiologie van darmnaadgenezing: een complexe cascade van celreacties en ontstekings-mediatoren – Hoofdstuk 2
Om de relevante celreacties die optreden tijdens een naadgenezing in kaart te brengen hebben we een literatuuronderzoek verricht. Hierbij werd geput uit kennis van studies over darmnaadgenezing en over andere vormen van wondgenezing zoals huid, bot en darmslijmvlies.
De darmwand bestaat uit meerdere lagen en de genezing hiervan, na beschadiging en na het maken van een darmanastomose, is complex. Er is een juiste interactie nodig tussen de bloedplaatjes, mestcellen, granulocyten, macrophagen, lymphocyten en fibroblasten die het weefsel infiltreren, en de cellen die al in het weefsel aanwezig zijn, zoals gladde spiercellen, epitheelcellen en mesenchymale stamcellen, maar ook neuronen, endotheelcellen, mesotheelcellen en talrijke immunologische cellen. Ontstekingactiviteit en eiwitafbrekende processen door deze cellen zijn nodig ter bescherming tegen pathogenen en om de weefselstructuur te herorganiseren, maar teveel van deze activiteit kan het weefselherstel weer verstoren. Voor een optimale genezing is het dus belangrijk dat de ontstekingsactiviteit op het juiste moment wordt afgerond en wordt overgegaan op proliferatieve processen die zorgen voor een sterk litteken. Dit is in de darm uitdagend omdat het proces verstoord kan worden door biologische factoren (bijvoorbeeld gal, darmenzymen en darmbacteriën) en mechanische factoren (bijvoorbeeld darmperistaltiek en hoge intraluminale druk). Als bepaalde medicijnen of andere risicofactoren zorgen voor extra verstoring, dan kan dit het verschil maken tussen wel of geen naadlekkage.
De interacties tussen cellen kunnen aangrijpingspunten zijn voor behandelingen, bijvoorbeeld met groeifactoren of hormonen, maar deze interacties en systemen zijn nog onvoldoende begrepen om adequate en doelgerichte behandelstrategieën te ontwikkelen.

Review van experimenteel onderzoek op het gebied van naadlekkage: de kwaliteit en de rapportage van dierenstudies moet verbeteren – Hoofdstuk 3
Er worden veel dierenstudies uitgevoerd op het gebied van naadlekkage, maar het is niet bekend wat de invloed hiervan is op de preventie en behandeling van naadlekkage in de kliniek. Omdat we volgens het actuele ‘3V’ principe dierexperimenteel onderzoek waar mogelijk willen vervangen, verminderen en verbeteren, hebben we een systematische review verricht om de kwaliteit van dierenstudies op het gebied van naadlekkage te evalueren.
Er werden in totaal 1.342 studies gevonden en het aantal publicaties nam vooral in het laatste decennium exponentieel toe. Van de 350 artikelen waarin experimentele therapieën werden bestudeerd, rapporteerden 298 (85%) een positief effect op de naadgenezing. Aangezien er slechts een beperkt aantal van deze therapieën wordt gebruikt of bestudeerd bij mensen, lijkt de vertaalbaarheid van uitkomsten van deze studies erg klein. Het viel op dat in gemiddeld 44.7% van de studies relevante studiemethoden en studieresultaten niet werden gerapporteerd. Het ging hierbij vooral om de beschrijving van de opgetreden naadcomplicaties (31.6%), perioperatief antibioticagebruik (75.7%), steriliteit aspecten van de operatieve procedure (83.4%) en toegepaste postoperatieve pijnstilling (91.4%). Naadlekkage werd alleen gerapporteerd als binaire uitkomstmaat (wel of geen lekkage), terwijl in de huidige literatuur wordt geadviseerd om lekkage ook te scoren aan de hand van de ernst en klinische consequenties (3, 5).
Het percentage studies waarin gebruik werd gemaakt van randomisatie, blindering van de chirurg en blindering van degene die de uitkomst onderzoekt, is de laatste twee decennia iets toegenomen maar is met respectievelijk 62.4%, 4.9% en 8.5% nog altijd ruim onvoldoende. Deze systematische review laat zien dat diermodellen voor naadlekkage erg verschillen wat betreft diersoort, darmsegment, uitkomstmaat en methode om lekkage te induceren. In tegenstelling tot maatschappelijke en politieke doelstellingen neemt het aantal dierstudies naar naadlekkage elk jaar toe terwijl de kwaliteit van het gepubliceerde onderzoek matig blijft. Zowel de kwaliteit als de rapportage van de studies moet worden verbeterd om de impact van het experimentele onderzoek op de kliniek te vergroten.

Diclofenac veroorzaakt lekkage in het ileum en de proximale dikke darm, maar niet in de distale dikke darm van de rat – Hoofdstuk 4
Meerdere studies hebben aangetoond dat er een verhoogd risico is op naadlekkage wanneer er rondom de operatie non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) gebruikt worden (6-11). Daarbij is het nog onduidelijk in welke mate NSAIDs verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van lekkage, welke subtypen NSAIDs schadelijk zijn, wat de relevantie is van de toegediende dosis en de timing hiervan, en welk darmsegment het meest kwetsbaar is voor de effecten van NSAIDs.
Klinische cohort studies over NSAID-gerelateerde naadlekkage hebben vooral groepen patiënten die colorectale chirurgie ondergingen onderzocht (7, 8, 12). Uit eerdere experimenten van onze groep bij ratten bleek dat NSAIDs juist lekkage veroorzaken van ileumnaden en niet van distale colonnaden (6, 13). Hieruit ontstond de vraag wat het effect zou zijn op naden in het proximale colon. In dit darmdeel lijkt de darmwand meer op het distale colon, terwijl de darminhoud (vloeibaarheid, darmbacteriën, galzouten) meer op het terminale ileum lijkt.
In Hoofdstuk 4 hebben we aangetoond dat diclofenac wel lekkage veroorzaakt in het proximale colon (73%), maar niet in het distale colon van ratten. Net als bij de ileumnaden ontstaan de meeste lekkages als diclofenac wordt toegediend vanaf de dag van operatie en neemt dit aantal af als de toediening wordt uitgesteld naar dag 1 en dag 2. De bevinding dat de genezing wel wordt verstoord in het ileum en proximale colon en niet in het distale colon suggereert dat de darminhoud in de proximale segmenten relevant is bij het ontstaan van een diclofenac-gerelateerde naadlekkage (14).

Het oppervlakkig beschadigen van de darmserosa, ten behoeve van het stimuleren van inflammatie en adhesievorming, vermindert niet de diclofenac-gerelateerde naadlekkage – Hoofdstuk 5
Enkele studies beschrijven dat NSAIDs de vorming van intraperitoneale adhesies onderdrukken (15-18). Dit fenomeen zou in theorie ook de darmnaadgenezing kunnen verzwakken. We hebben een rattenmodel ontworpen om te bestuderen of het stimuleren van de inflammatoire respons en de ontwikkeling van littekenweefsel rondom een proximale colonnaad de aan de diclofenac gerelateerde lekkage kan voorkomen.
In Hoofdstuk 5 hebben we deze inflammatoire en adhesieve processen uitgelokt door een mechanische interventie, zoals ook wordt gedaan in experimentele studies naar adhesievorming. De interventie bestond uit het oppervlakkig opschuren van de serosa aan de randen van de naad, vlak voordat de naad wordt gehecht. Histologische analyse liet zien dat dit in veel gevallen leidde tot vast en uitgebreid littekenweefsel, terwijl het weefsel losmazig bleef bij controle naden zonder voorbewerking. Dit resulteerde echter niet in een sterkere naad en ook niet in vermindering van naadlekkages. Het lijkt alsof de genezing en sterkte van de darmnaad dus niet afhangen van de verklevingen aan de serosale zijde van de naad. De schadelijke effecten van diclofenac op de naad kunnen niet worden tegengegaan door de gebruikte fibrose-inducerende technieken.

De uitscheiding van diclofenac via gal heeft een nadelige invloed op de genezing van ileumnaden – Hoofdstuk 6
NSAIDs die worden geklaard door de lever (diclofenac, carprofen, celecoxib) veroorzaken meer lekkage dan de NSAIDs die voor het grootste deel worden uitgescheiden door de nieren (naproxen) (6, 13, 19). Meerdere studies schrijven ook NSAID-geïnduceerde dunne darmschade, die optreedt zonder operatie, toe aan de hepatogene klaring en biliaire uitscheiding van NSAIDs (20-27). Op grond hiervan vroegen we ons af of de verandering in de galsamenstelling door NSAID gebruik invloed heeft op het ontstaan van naadlekkage.
In Hoofdstuk 6 hebben we deze relevantie van de galsamenstelling onderzocht in 138 ratten en met gebruik van 72 ratten als galdonoren. Door het canuleren van de ductus choledochus werd de gal afgetapt en via een canule in het duodenum werd donorgal teruggegeven. Het lekkagepercentage was 28% als er ‘diclofenac-gal’ werd gegeven ten opzichte van 6% (p=0.089) wanneer er controlegal werd gegeven. Na orale toediening van diclofenac was er een 76% lekkage percentage als de ratten hun ‘diclofenac-gal’ terugkregen en dit percentage was 47% (p=0.127) als het werd vervangen door controle gal. Na intramusculaire toediening van diclofenac lekte 67% van de naden, er lekte 25% (p=0.060) als de gal volledig werd afgetapt. Als na intramusculaire toediening van diclofenac de gal eerst werd afgetapt en dan teruggeven was er 50% lekkage, en als het gal werd vervangen door controlegal dan was er 20% lekkage (p=0.117). Samenvattend was er een significant ernstigere lekkage waarneembaar in de groepen die ‘diclofenac-gal’ kregen in vergelijking met controle groepen. Met behulp van High Performance Liquid Chromatography en Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCMS) analyses toonden we aan dat de spiegels van diclofenac metabolieten in gal binnen twee uur na toediening pieken. Hieruit blijkt dat de veranderde galsamenstelling al kort na de diclofenac toediening de darm bereikt.
Deze studie laat zien dat een veranderde galsamenstelling door diclofenac toediening de genezing van ileumnaden bij ratten verstoort. Er kon niet worden vastgesteld of deze verstoring komt door een veranderde galzoutsamenstelling, door de gemetaboliseerde vorm van diclofenac, of door de niet omgezette diclofenac in de darm.

Remming van microbiële glucuronidase activiteit in de darm, om reactivatie van diclofenac metabolieten in de darm te voorkomen, vermindert diclofenac geïnduceerde naadcomplicaties bij ratten – Hoofdstuk 7
Uit experimentele studies blijkt dat reactivatie van de biliaire metaboliet diclofenac-acyl glucuronide door bacteriële glucuronidase activiteit in de darm leidt tot schade aan de dunne darmmucosa. De door Wallace et al. ontwikkelde Inh1, die glucuronidase activiteit blokkeert, voorkomt het ontstaan van de mucosale schade en ulcera (23, 28). In Hoofdstuk 7 hebben we in 90 ratten onderzocht of Inh1 ook naadlekkage kan voorkomen na toediening van diclofenac. Toediening van Inh1 kon lekkage niet voorkomen, resulteerde in een niet significante daling van 89% naar 44% (p=0.094) maar verminderde wel significant de ernst van de lekkages (p=0.029). Uit de LCMS analyse bleek dat de plasmaspiegels van diclofenac onveranderd waren bij toediening van Inh1. De bevinding dat een glucuronidase remmer naadcomplicaties vermindert, suggereert dat reactivatie van diclofenac-acyl-glucuronide in de darm schadelijk is voor de genezing van ileumnaden. Bij mensen is er humaan glucuronidase aanwezig tussen de darmvilli, maar wordt het grootste deel van dit enzym geproduceerd door darmbacteriën. Dit suggereert een additionele rol van de darmflora in de pathophysiologie van naadlekkage door diclofenac.

Darmchirurgie veroorzaakt een duidelijke verandering in de samenstelling en diversiteit van het microbioom, terwijl toediening van diclofenac hier geen duidelijk effect op heeft – Hoofdstuk 8
Om de rol van de darmflora bij diclofenac-geïnduceerde naadlekkage verder te onderzoeken, hebben we in verschillende darmsegmenten onderzocht of en hoe het microbioom verandert door de operatie en door de toediening van diclofenac. Het blijkt dat alleen al de operatie zorgt voor significante veranderingen in het microbioom, zowel in het ileum, het proximale colon als het distale colon. Een korte kuur van diclofenac na de operatie leidde niet tot verdere veranderingen. In deze explorerende studie konden we geen effect van diclofenac aantonen op de samenstelling van de darmflora. Mogelijk maskeerde het grote effect van de operatie dat van de diclofenac. We hebben in deze studie niet onderzocht wat het effect is van diclofenac op de virulentie van darmbacteriën. Bacteriële virulentie is een factor die in andere onderzoeken is gerelateerd aan naadlekkage. Uit de studie in hoofdstuk 8 kan worden geconcludeerd dat de samenstelling van het microbioom significant verandert als gevolg van een darmresectie en het aanleggen van een darmnaad.

Conclusie
Dit proefschrift bevat een overzicht van de verschillende cellulaire interacties die relevant zijn tijdens darmnaadgenezing en beschrijft waarom het proces van naadgenezing nog onvoldoende begrepen wordt. Er wordt beschreven dat de kwaliteit van experimenteel onderzoek naar darmnaadgenezing matig is en dat er vooral behoefte is aan betere rapportage en gebruik van betere methodes om bias te voorkomen.
In dit proefschrift wordt aangetoond dat de invloed van diclofenac op darmnaadgenezing verschilt per locatie in de darm en dat de uitscheiding van diclofenac via gal relevant is bij het ontstaan van naadcomplicaties in de rat. Een enterale interventie, gericht op het metabolisme van diclofenac moleculen door darmbacteriën, vermindert de effecten van diclofenac.
Deze nieuwe bevindingen dat luminale factoren en bijpassende interventies invloed hebben op de experimentele naadgenezing opent de weg naar toekomstig naadlekkage onderzoek gericht op luminale factoren. Een luminale factor van omvang is het microbioom en in dit proefschrift wordt in detail beschreven dat darmchirurgie hierin significante veranderingen teweeg brengt. Een specifieke samenstelling van de darmflora, of veranderingen hierin, kunnen de darmnaad kwetsbaarder maken voor lekkage in het algemeen, of specifiek bij gebruik van diclofenac, hoewel dit laatste niet door ons kon worden aangetoond.