Stephanie Gumbs

Sinds de introductie van antiretrovirale therapie (ART) is een infectie met het humaan immunodeficiëntie virus (hiv) in de meeste gevallen een chronische aandoening, met een normale levensverwachting. Behandeling van hiv is erop gericht om de hoeveelheid virus in het lichaam (virale load) te onderdrukken tot ondetecteerbare waarden door het vermenigvuldigen (replicatie) van het virus te voorkomen. Echter, ondanks langdurige behandeling, is ART niet in staat om hiv te genezen. Dit komt omdat het virus zich, direct na infectie, nestelt in het DNA van onze afweercellen waarin het “slapend” aanwezig blijft, het zogenaamd latent viraal reservoir. ART verhindert de infectie van nieuwe cellen, maar kan deze reservoircellen niet verwijderen. Hierdoor dient ART levenslang te worden voortgezet om te voorkomen dat het reservoir “wakker” wordt (reactiveert) en in afwezigheid van ART weer nieuw infectieus virus produceert (virale rebound). De genezing van hiv berust dus op het vermogen om deze geïnfecteerde reservoircellen te verwijderen of de productie van nieuw infectieus virus permanent te blokkeren.

Het is bekend dat hiv zich ook in de hersenen nestelt. Maar hoe, waar precies en wat het volledige gevolg is, is nog onduidelijk. De hersenen vormen samen met het ruggenmerg het centrale zenuwstelsel (CZS), een uniek anatomisch compartiment dat beschermt wordt door de bloed-hersenbarrière (BBB) en omgeven is door hersenvocht (CSF). De persistentie van hiv in het CZS draagt bij tot de ontwikkeling van een spectrum van cognitieve stoornissen die gezamenlijk hiv-geassocieerde neurocognitieve stoornis (HAND) wordt genoemd. Ondanks langdurige behandeling treedt bij 20-50% van de hiv-geïnfecteerd populatie nog steeds HAND op, waarvan de meeste een milde vorm hebben.

In dit proefschrift leveren we bewijs ter ondersteuning van het CZS als een viraal reservoir voor hiv. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van verschillende kweekmodellen en technieken om hiv-infectie in het CZS te onderzoeken. Eerst beschrijven we in hoofdstuk 2, een overzicht van kweekmodellen die gebruikt kunnen worden om hiv-infectie in het CZS en met name in de microglia cellen te onderzoeken. In de daaropvolgende hoofdstukken leveren we bewijs ter ondersteuning van het CZS als viraal reservoir, waaronder de verschillen tussen de virus populatie in hersenvocht en bloed (hoofdstuk 3), detectie van intact hiv-DNA in hersenweefsel gedurende langdurige ART (hoofdstuk 4), en het ontrafelen van de target cellen van hiv in de hersenen (hoofdstuk 5). Als laatst geven we in hoofdstuk 6 een overzicht van de huidige literatuur over hiv-genezing strategieën en impact op het CZS viraal reservoir.

Hiv en de CZS
Bij het binnendringen van het lichaam gaat het virus op zoek naar target cellen die een CD4 receptor en een hulp receptor, CCR5 of CXCR4, aan de buitenkant van de cel tot expressie brengen. Het virus gebruikt deze twee receptoren als een soort antenne om aan de cel te binden en vervolgens te infecteren. In het bloed infecteert hiv voornamelijk CD4 positieve T-lymphocyten, kortweg CD4-cellen. Door de CD4-cellen te gebruiken als een soort kopieermachine, kan hiv zichzelf vermenigvuldigen en vervolgens een groot aantal nieuwe virussen verspreiden door het lichaam waaronder naar het centrale zenuwstelsel.

Kort na de primaire infectie, dringt hiv de hersenen binnen. In hoofdstuk 3 hebben we de hoeveelheid virus (virale load) in bloed en hersenvocht van mensen met hiv die niet op behandeling zijn geanalyseerd en vonden dat in de meeste individuen (84%) de virale load in het hersenvocht significant lager is dan in het bloed. Hiernaast vonden we 3 individuen die meer virus in het hersenvocht hadden dan in het bloed. Deze bevindingen duiden erop dat de toegang van hiv naar de hersenen selectief is en dat waarschijnlijk ook hiv-productie en/of replicatie in de hersenen plaatsvindt.

Het is bekend dat twee celtypes in de hersenen, namelijk microglia en perivasculaire macrofagen, de CD4 receptor en de hulp receptor CCR5 tot expressie brengen. Hierdoor zijn deze cellen, naast de vanuit het bloed infiltrerende CD4-cellen de meest waarschijnlijke target cellen in het CZS die door hiv geïnfecteerd kunnen worden. In post-mortem (na de dood) hersenonderzoek van hiv-positieve individuen wordt hiv-DNA ook het vaakst aangetroffen in deze microglia en perivasculaire macrofagen. Deze cellen hebben een lange halfwaardetijd van ongeveer 3 maanden (macrofagen) tot 4.2 jaar (microglia). Microglia zijn, in tegenstelling tot macrofagen, een zelfvoorzienende populatie en hebben hiernaast ook speciale mechanismen om het virus in slaap, oftewel latent, te houden. Hierdoor zou hiv voor een lange tijd in de hersenen kunnen overleven. Naast microglia en perivasculaire macrofagen worden astrocyten ook verdacht vatbaar te zijn voor hiv-infectie hoewel dit in het hiv onderzoeksveld controversieel is, omdat astrocyten geen CD4 receptor tot expressie brengen.

Helaas is het zelden mogelijk om humaan hersenweefsel direct te bestuderen, voornamelijk omdat het moeilijk is om vers humaan hersenweefsel te krijgen. Hierdoor gingen we in hoofdstuk 2 op zoek naar een humaan microglia kweek model dat geschikt is voor hiv-onderzoek. We hebben onderzocht hoe goed de verschillende modellen in staat zijn om de echte microglia zoals verkregen uit hersenweefsel na te bootsen en of ze een productieve hiv-infectie kunnen ondersteunen. Onder productieve hiv-infectie verstaan we het vermogen van een cel om geïnfecteerd te raken en vervolgens nieuwe infectieuze virussen te produceren. Tot voor kort, werd microglia-onderzoek doorgaans uitgevoerd op microglia cellijnen, monocyten-afgeleide microglia (MDMi) en geïsoleerde microglia uit humaan hersenweefsel, de zogenaamde primaire microglia (pMG). Recente technologische vooruitgang in stamcelonderzoek heeft de functionele modellering van de humane hersenen mogelijk gemaakt door het omzetten van stamcellen tot een verscheidenheid van hersencellen, waaronder microglia (iPSC-MG) en 3D cerebrale organoïden.

Wij vonden dat hoewel elk microglia kweekmodel, behalve de microglia cellijnen, verschillende aspecten van de celstructuur en de functie van microglia kan repliceren, geen enkel kweekmodel in staat is om de echte microglia in de hersenen volledig na te bootsen. Desondanks vonden we dat primaire microglia, monocyten-afgeleide microglia en cerebrale organoïden productieve hiv-infectie ondersteunen met behulp van de CD4 receptor en de CCR5 hulpreceptor die op alle 3 kweekmodellen tot expressie komt. In tegenstelling tot primaire microglia en monocyten-afgeleiden microglia, was de infectie in cerebrale organoïden beperkt met weinig virale spreiding en is hierdoor het meest representatief voor hiv-infectie in de hersenen. Al met al, zijn primaire microglia, monocyten-afgeleide microglia en cerebrale organoïden, op basis van onze bevindingen, allemaal geschikte microglia kweekmodellen voor hiv-onderzoek hoewel cerebrale organoïden en ook de infectie hiervan de meeste gelijkenissen vertonen met de echte infectie van microglia in de hersenen.

Hiv infectie in de CZS
Na het bepalen van het beste kweekmodel hebben we in hoofdstuk 5 de cerebrale organoïden gebruikt om te onderzoeken welke hersencellen, naast microglia, mogelijk vatbaar zijn voor productieve hiv-infectie. 3D cerebrale organoïden worden vaak mini-breintjes genoemd, wat suggereert dat het om kleine versies van de complexe menselijke hersenen gaat. In werkelijkheid, zijn de humane hersenen te complex om volledig na te bootsen in een laboratorium. Echter de cerebrale organoïden zijn kleine 3D hersenstructuren (2 tot 5mm groot) die een grote verscheidenheid van hersencellen waaronder microglia, astrocyten en neuronen laten zien, die zich structureel organiseren zoals in de ontwikkelende hersenen tijdens de zwangerschap. Door deze cerebrale organoïden te infecteren met een hiv-virus met een fluorescentie label, konden we vaststellen welke cellen geïnfecteerd raakten door de fluorescentie onder de microscoop te visualiseren. Het enige celtype dat productief door hiv geïnfecteerd kon worden, waren de microglia. Hiernaast waren er ook verschillende overeenkomsten tussen hiv-infectie in de cerebrale organoïden en hiv-infectie in de hersenen, waaronder beperkte infectie, weinig virale spreiding en de typische grote microglia complexe celstructuren die vaak gezien wordt in het hersenweefsel van hiv-positieve individuen met hiv-geassocieerde dementia en encefalitis.

Hoewel we nu overtuigend bewijs hebben dat microglia het hoofddoelwit van hiv in de hersenen is, is er één kenmerkend verschil tussen de distrubutie van de CD4 en de CCR5 receptor op microglia en CD4-cellen in bloed. Vergeleken met de CD4 positieve T cellen, is de dichtheid van de CD4 en CCR5 receptoren aan de buitenkant van microglia veel lager. Hierdoor wordt het verondersteld dat, tijdens chronische hiv-infectie, de virussen afkomstig van het bloed zich genetisch aanpassen aan de lage oppervlaktedichtheid van de hiv receptoren op microglia om ze vervolgens effectief te kunnen infecteren. In hoofdstuk 3 hebben we in een groep van hiv-positieve individuen die niet op behandeling stonden, onderzocht of er genetische verschillen zijn tussen virussen in het bloed en virussen in het hersenvocht. Hiernaast we gekeken hoe goed deze virussen CD4-cellen en microglia infecteren. Uit onze studiepopulatie bleek dat er over het algemeen weinig genetische verschillen zijn tussen de viruspopulaties in hersenvocht en bloed in de meeste individuen, maar bij twee individuen vonden we dat de viruspopulatie in het hersenvocht aanzienlijk verschilde van de viruspopulatie in het bloed. Dit noemen we compartmentalizatie. De detectie van CZS compartmentalizatie in deze twee individuen duidt erop dat er hoogstwaarschijnlijk niet alleen hiv-infectie maar ook replicatie plaatsvond in hersencellen, dat leidde tot de productie van deze CZS-specifieke virussen. Daarnaast, hoewel alle virussen de CD4-cellen konden infecteren, waren de meeste virussen niet in staat om microglia te infecteren. Dit suggereert dat deze CZS-specifieke virussen waarschijnlijk geproduceerd zijn door T cellen in het CZS. Echter waren er wel enkele virussen die het redelijk goed deden in microglia. Het is nog de vraag of deze virussen tussenproducten zijn op weg naar de transformatie tot virussen die effectief microglia kunnen infecteren.

Het CZS als een hiv-reservoir
Kortom, de bovengenoemde studies leveren samen bewijs voor hiv-infectie en replicatie in het CZS, maar om vast te stellen dat het CZS een hiv-reservoir is hebben we hard bewijs nodig van geïnfecteerde reservoircellen in de hersenen die na reactivatie in staat zijn om nieuwe virussen te produceren die ook weer nieuwe cellen kunnen infecteren. Om kopieën van zichzelf te kunnen maken moet eerst het RNA van hiv ingebouwd worden in het DNA van de cel. Hiervoor gebruikt hiv twee virale eiwitten (enzymen) namelijk reverse-transcriptase, die het viraal RNA omzet in viraal DNA, en integrase die ervoor zorgt dat het virale DNA ingebouwd wordt in het DNA van de cel. Reverse transcriptase maakt constant fouten tijdens het omzetten van RNA in DNA, waardoor het meeste hiv-DNA in CD4-cellen defect is en geen nieuw infectieus virus kan produceren.

Voorgaande post-mortem studies hebben stukjes hiv-DNA aangetoond in de hersenen, voornamelijk in microglia en macrofagen, maar om beschouwd te worden als een onderdeel van het hiv-reservoir moet dit hiv-DNA intact zijn. In hoofdstuk 4 kijken wij naar de integriteit van hiv-DNA in hersencellen geïsoleerd uit een individu met hiv op langdurige behandeling (post-mortem). Hiervoor hebben we een nieuwe techniek toegepast, genaamd IPDA (intact proviral DNA assay), waarmee we een onderscheid kunnen maken tussen intact en defect hiv-DNA. Zoals verwacht was alleen een klein deel van het totale hiv-DNA intact (13%), maar de prevalentie van intact DNA was ongeveer 2.8-voud hoger in microglia dan in de resterende hersencellen. Dit levert verder bewijs op dat microglia de meest waarschijnlijke reservoircel voor hiv in het CZS is, maar wijst erop dat ook andere celtypes intact hiv-DNA zouden kunnen hebben en mogelijk kunnen fungeren als een reservoir. Het is nog de vraag of deze reservoircellen met intact hiv-DNA ook in staat zijn om na reactivatie nieuw infectieus virus te produceren die vervolgens bijdraagt aan virale rebound. Om hier inzicht in te krijgen hebben we een belangrijk onderdeel van het hiv-DNA verder onderzocht. Dit is het zogenaamde virale envelop eiwit, dat verantwoordelijk is voor het binden van het virus aan de hiv receptoren op de cel. We vonden dat het envelop stuk van de virussen, geïsoleerd uit de bovengenoemde microglia hersencellen, intact is en effectief konden binden aan de CD4 en CCR5 receptor van CD4-cellen. Na binding, kon het virus de cel binnendringen, zichzelf inbouwen in het DNA van de CD4-cel en vervolgens nieuwe infectieus virus aanmaken. Dit preliminaire experiment ondersteunt het potentieel van microglia-specifieke virussen om naast virale rebound in het CZS ook bij te dragen aan de virale rebound in het bloed door infectie en replicatie in (perifere) CD4-cellen.

Hiv genezing en het CZS reservoir
Hiv is helaas nog niet globaal te genezen. Wereldwijd zijn er 4 mensen genezen van hiv na het ondergaan van een stamceltransplantatie. Helaas kan stamceltransplantatie niet op grote schaal gebruikt worden als genezing voor hiv omdat de kans op overlijden bij een stamceltransplantatie erg groot is. Het hoofddoel van hiv-genezing strategieën is om hiv-positieve individuen in staat te stellen hun hiv-therapie te staken zonder de gevolgen van virale rebound en de daaropvolgende opportunistische infecties die uiteindelijk leiden tot AIDS.

Naast stamceltransplantatie worden er verschillende manieren onderzocht om het slapende virus te verwijderen uit het lichaam en/of permanent te onderdrukken. Twee van de meest veelbelovende hiv-genezing strategieën zijn de “Block and Lock” en de “Shock and Kill” strategie. De block and lock strategie heeft tot doel om geïnfecteerde reservoircellen permanent in een diepe slaap te vergrendelen (lock) om reactivatie en nieuwe virus productie te voorkomen (block). De shock and kill strategie, daarentegen, is de meest onderzochte strategie voor hiv-genezing en berust op het reactiveren van de geïnfecteerde reservoircellen (shock), zodat ze herkent en opgeruimd kunnen worden door het immuunsysteem (kill).

In hoofdstuk 6 hebben we uitvoerig de shock and kill strategie besproken met betrekking tot eradicatie van het CZS reservoir. Het succes van deze strategie bij de eradicatie van het CZS reservoir is sterk afhankelijk van het vermogen om de reservoircellen in de hersenen efficiënt te activeren zonder gevaarlijke inflammatie en toxiciteit in de hersenen te veroorzaken. Even belangrijk is het binnendringen van immuuncellen vanuit het bloed in het CZS om effectief de geactiveerde reservoircellen op te ruimen. Tot nu toe is uit onderzoek gebleken dat het mogelijk is om een deel van de slapende virussen in het reservoir te reactiveren, maar helaas is het nog niet gelukt om het virus hierna uit te schakelen en het viraal reservoir te verkleinen. Momenteel wordt er onderzoek gedaan om te kijken hoe we de reactivatie van de reservoircellen kunnen optimaliseren en het immuunsysteem versterken om het virus beter op te ruimen.

Conclusie
In dit proefschrift, leveren we sterke aanwijzingen dat het CZS kan functioneren als een viraal reservoir voor hiv. Wij hebben de microglia geïdentificeerd als het hoofddoelwit van hiv in de hersenen, CZS-specifieke virussen gevonden die aanzienlijk verschilde van de virussen in het bloed en in het bijzonder voor het eerst intact hiv-DNA aangetoond in post-mortem verkregen hersencellen van iemand met hiv die langdurig antiretrovirale behandeling had ondergaan.

Op basis van voorgaande studies zoals beschreven in de wetenschappelijke literatuur, in combinatie met onze eigen bevindingen, zijn we overtuigd dat microglia de voornaamste reservoircel is voor hiv in het CZS en ongetwijfeld een belangrijke rol speelt in het bereiken van hiv genezing. Om CZS te betrekken bij strategieën voor genezing van hiv, hebben wij een uitgebreid begrip nodig van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het vormen en behouden van hiv in de slaapstand in deze cellen. Hiervoor kunnen we de verschillende microglia kweekmodellen gebruiken, waaronder primaire microglia, monocyten-afgeleide microglia en 3D cerebral organoïden, benoemd in hoofdstuk 2. Tenslotte bevelen wij aan om CZS-monitoring toe te voegen aan lopende en toekomstige klinische studies gericht op de genezing van hiv om mogelijke schadelijke neveneffecten op het CZS te beperken en tegelijkertijd meer inzicht te krijgen in het CZS viraal reservoir.