Ton Winkelmolen

Hoe een plant eruit ziet, oftewel plantenarchitectuur, kan heel erg veranderen en wordt beïnvloed door meerdere factoren en kan belangrijk zijn om te overleven in diens omgeving. Zo is er niet alleen verschil tussen soorten maar ook binnen dezelfde soort kan er veel verschil zitten. Tijdens evolutie is er zo een grote variatie aan verschillende planten en hoe ze eruit zien ontstaan. Toen mensen bepaalde plantensoorten gingen telen, werd er geselecteerd voor bepaalde eigenschappen in plantenarchitectuur om het gebruik voor de mens te verbeteren. Sommige van deze belangrijke eigenschappen zijn op een moleculair niveau aan elkaar gekoppeld. Dat betekent dat wanneer je de ene eigenschap wil sturen, je vaak ook andere eigenschappen mee verandert. Bij gerst is dit ook het geval, waarbij het aantal zijscheuten en rij-type, het aantal graankorrels per aar, door dezelfde transcriptiefactor gereguleerd wordt, namelijk VULGARE ROW-TYPE SIX 5 (VRS5). Beide eigenschappen zijn belangrijk voor de uiteindelijke opbrengst, en door deze genetische koppeling is het moeilijk om deze eigenschappen onafhankelijk van elkaar te sturen. Het overkoepelende doel in dit proefschrift is om op moleculair niveau beter te begrijpen hoe deze eigenschappen aan elkaar gekoppeld zijn, met de focus op VRS5.

VRS5 is een transcriptiefactor, dat betekent dat het de expressie van onderliggende genen kan reguleren door direct aan DNA te binden. Door te onderzoeken welke genen dit precies zijn, kunnen we beter begrijpen hoe VRS5 precies werkt en hoe het verschillende eigenschappen kan beïnvloeden. In Hoofdstuk 2, hebben we deze onderliggende genen geïdentificeerd door twee technieken te combineren. Door gebruik te maken van DNA-affinity purification gevolgd door sequencing (DAP-seq), hebben we over het hele gerstgenoom de locaties gevonden waar VRS5 bindt. Daarnaast hebben we de genexpressie vergeleken van wild-type planten en planten die een mutatie hebben in VRS5, oftewel vrs5 mutanten, in vier verschillende ontwikkelingsstadia met RNA-sequencing. Door de verschillend gereguleerde genen in vrs5 planten te combineren met de locaties in het genoom waar VRS5 bindt, hebben we een lijst met genen die zowel gebonden als gereguleerd worden door VRS5. Door dit in vier verschillende ontwikkelingsstadia te doen, konden we zien welke van deze onderliggende genen vooral vroeg in de ontwikkeling, en waarschijnlijk dus bij het maken van zijscheuten belangrijk zijn, terwijl andere, die vooral later in de ontwikkeling, en dus pas bij de ontwikkeling van de aar, belangrijk zijn.

Vervolgens hebben we in meer detail gekeken naar VRS5 als eiwit in Hoofdstuk 3. We hebben gevonden dat er twee verschillende VRS5 eiwitten gevormd kunnen worden; VRS5α en VRS5β. We wilden onderzoeken of deze verschillende isoformen ook een anders functioneren. Door gebruik te maken van CRISPR mutagenese, hebben we een mutatie gemaakt waardoor er maar een van deze isoformen gevormd kan worden. We zagen dat in deze planten de koppeling tussen het vormen van zijscheuten en het rij-type verdwenen is. vrs5 mutanten, waarbij geen enkel VRS5 eiwit gevormd kan worden, hebben zowel meer zijscheuten, als een aar met zes rijen graankorrels. vrs5α mutanten, waarbij alleen VRS5β gevormd kan worden, hebben meer zijscheuten, maar een aar met twee rijen graankorrels. We laten verder zien dat deze verschillen waarschijnlijk veroorzaakt worden door verschillen in de DNA-binding van de verschillende isoformen als ze een complex vormen met een andere transcriptiefactor, TB2.

Een van de direct onderliggende genen van VRS5 die we in Hoofdstuk 2 geïdentificeerd hebben, VRS1, was in gerst al bekend als een gen dat rij-type reguleert. Hoewel rij-type een erg belangrijke agronomische eigenschap is voor gerst, is er moleculair erg weinig bekend over hoe VRS1 functioneert. In Hoofdstuk 4, hebben we aangetoond aan welke DNA-sequentie VRS1 kan binden als transcriptiefactor, door gebruik te maken van DAP-seq. In combinatie met bestaande genexpressiedata van een VRS1 allel, hebben we ook mogelijke direct onderliggende genen van VRS1 geïdentificeerd. Een van deze genen is SOC1-like, waar we met CRISPR ook mutanten van hebben gemaakt. Deze mutanten hebben net als wild-type een twee-rijige aar, maar de laterale graankorrels in soc1-like mutanten zijn significant kleiner vergeleken met die van wild-type. Door natuurlijke variatie in de DNA-sequentie van SOC1-like te analyseren, zagen we dat er een sterke selectie is geweest voor een bepaalde mutatie in SOC1-like in zes-rijige gerst.

Veel van de experimenten die in dit proefschrift gedaan zijn, zouden onmogelijk zijn zonder een efficiënt CRISPR mutagenese protocol. In Hoofdstuk 5 hebben we laten zien hoe we de efficiëntie van Cas9 in gerst hebben verbeterd door verschillende methodes te combineren. Met dit verbeterde systeem hebben we veel planten ontwikkeld met knock-out mutaties en zelfs knock-out mutaties van twee genen tegelijk, al in de primaire transformanten.

Uiteindelijk combineer ik in Hoofdstuk 6 de behaalde resultaten en plaats ze samen in een breder wetenschappelijk perspectief. Ik benoem specifiek de geconserveerde functie van VRS5 in het reguleren van het maken van zijscheuten, terwijl ik sommige interessante direct onderliggende genen van VRS5 benoem die mogelijk de ontwikkeling van laterale graankorrels reguleren. Met de moleculaire inzichten uit dit proefschrift laat ik meerdere opties zien die helpen bij het ontkoppelen van verschillende opbrengsteigenschappen in gerst, specifiek via VRS5.