Jing Wang

Huanglongbing (HLB), of de citrusvergroeningsziekte, is een van de meest verwoestende bedreigingen voor de wereldwijde citrusproductie. Het wordt veroorzaakt door de aan het floëem gebonden bacterie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), die wordt overgebracht door de Aziatische citrusbladvlo (Diaphorina citri). De ziekte leidt tot floëemblokkade, bladchlorose, vruchtvervorming en uiteindelijk de dood van de boom. Ondanks decennia aan onderzoek is de vooruitgang in het begrijpen van de moleculaire basis van de interacties tussen CLas en de gastheer beperkt gebleven door drie belangrijke belemmeringen: het onvermogen om CLas te kweken, het gebrek aan gesynchroniseerde infectiesystemen voor studies in vroege stadia, en de afwezigheid van hanteerbare in planta-modellen voor het valideren van genfuncties of medicijnen. In dit proefschrift heb ik geprobeerd deze uitdagingen aan te pakken door nieuwe experimentele methoden te ontwikkelen en nieuwe mechanistische perspectieven voor te stellen die samen ons begrip van de biologie van CLas en de pathogenese van HLB vergroten.

In hoofdstuk 1 introduceer ik de historische achtergrond, epidemiologie en biologische kenmerken van Candidatus Liberibacter asiaticus en HLB, waarbij ik samenvat waarom de vooruitgang op dit gebied traag is verlopen. Ik schets de drie belangrijkste knelpunten in het HLB-onderzoek — het gebrek aan een kweekbare bacterie, de afwezigheid van gesynchroniseerde infectiesystemen in vroege stadia en de uitdagingen van het bestuderen van floëemspecifieke reacties in hele bladmonsters — evenals de beperkingen van de huidige bestrijdingsstrategieën. Dit hoofdstuk stelt de conceptuele en technische hiaten vast die de ontwikkeling van nieuwe methodologieën in het hele proefschrift motiveren.

In hoofdstuk 2 hebben we een aangepast micro-entingsysteem (MiG) ontwikkeld dat een snelle en gesynchroniseerde infectie van citruszaailingen mogelijk maakt met behulp van knoppen van HLB-symptomatische enten. Dit systeem bereikte een systemische CLas-invasie binnen 40 dagen — aanzienlijk sneller dan conventionele enting of door bladvlooien gemedieerde inoculatie. Met behulp van lasermicrodissectie (LCM) van floëemweefsels gevolgd door RNA-sequencing hebben we het eerste floëemspecifieke vroegstadium-transcriptoom gegenereerd van citrus die op CLas reageert. Via deze aanpak identificeerden we 75 niet eerder gerapporteerde vroeg-reagerende genen. Deze genen bieden niet alleen inzicht in vroege reacties van de gastheer, maar vertegenwoordigen ook veelbelovende infectie-induceerbare promotoren voor gerichte antimicrobiële toepassingen.

In hoofdstuk 3 heb ik 79 paren homologe genen geanalyseerd die worden gedeeld tussen CLas en het symbiotische megaplasmide pSymA van Sinorhizobium meliloti (Sme) om te onderzoeken hoe CLas zijn genregulatie heeft ontwikkeld in vergelijking met zijn vrijlevende verwanten. Door dubbele promotor-reporterfusies te construeren en deze tot expressie te brengen in het Sme-Medicago-knolletjessysteem, heb ik de promotoractiviteiten in planta gevisualiseerd. Ik ontdekte dat geen van de homologe paren een identiek expressiepatroon vertoonde. CLas-promotoren waren vaak actief in infectiedraden en symbiosomen, terwijl hun pSymA-tegenhangers zwak of inactief waren. Deze resultaten geven aan dat de regulatoire netwerken van CLas diepgaand zijn afgeweken van die van rhizobia, wat waarschijnlijk een aanpassing weerspiegelt aan een stabiele intracellulaire floëemniche.

In hoofdstuk 4 heb ik de Sme-Medicago wortelknolletjessymbiose gebruikt als heteroloog model om de CLas-transcriptiefactor RpoH te bestuderen, een belangrijke regulator van stressreacties, om functionele testen van CLas-genen in planta mogelijk te maken. Deletie van RpoH in Sme veroorzaakte ernstige defecten in de ontwikkeling van de knolletjes. Complementatie met CLas RpoH herstelde de knolletjesvorming gedeeltelijk, wat functionele conservering tussen de twee soorten aantoont. Belangrijk is dat de eerder geïdentificeerde remmer rosiglitazonmaleaat dit complementatie-effect omkeerde en ook de CLas-titers in geïnfecteerde citruszaailingen onderdrukte. Ik heb zo een hanteerbaar in planta screeningsplatform opgezet voor CLas functionele assays en de evaluatie van medicijnen, wat een waardevolle brug vormt tussen moleculaire studies en toegepaste ziektebestrijding.

In hoofdstuk 5 heb ik grootschalige fylogenomische analyses uitgevoerd van meer dan 1.600 α-proteobacteriële genomen met behulp van de meest geconserveerde AMPHORA-huishoudgenen. Mijn resultaten lieten zien dat Liberibacter-soorten genest zijn binnen het geslacht Rhizobium, in plaats van een aparte lijn te vormen. Dit staat in contrast met eerdere studies, die sneller evoluerende gensets gebruikten en waarschijnlijk werden beïnvloed door long-branch attraction. De verfijnde fylogenetische plaatsing impliceert dat Liberibacter een gespecialiseerde, in genoom gereduceerde Rhizobium-lijn vertegenwoordigt die zich onafhankelijk heeft aangepast aan het intracellulaire leven in floëem- en bladvlo-gastheren. Dit evolutionaire inzicht verduidelijkt niet alleen de taxonomische positie van CLas, maar ondersteunt ook het gebruik van op Rhizobium gebaseerde systemen als surrogaten voor de studie ervan.

Samen bieden deze studies een kader dat moleculaire mechanismen, experimentele modellen en de evolutionaire context met elkaar verbindt. Door een snel en gesynchroniseerd infectiesysteem op te zetten, in planta-surrogaatmodellen te ontwikkelen en de evolutionaire wortels van CLas opnieuw te definiëren, heb ik zowel praktische instrumenten als conceptuele vooruitgang bijgedragen aan de studie van HLB. De MiG-LCM-aanpak maakt de ontdekking van vroege verdedigingsmarkers en induceerbare promotoren mogelijk; de op rhizobium gebaseerde systemen maken functionele gentesten en remmerscreening mogelijk; en de fylogenetische reconstructie plaatst CLas binnen het geslacht Rhizobium.

Gezamenlijk opent dit werk nieuwe richtingen voor functionele genomica, moleculaire pathologie en gerichte manipulatie van HLB-resistentie in citrus, wat de weg vrijmaakt voor een duurzaam beheer van HLB en andere floëem-beperkte bacteriële ziekten.