Anne Zeddeman

Pertussis, ook wel kinkhoest genoemd, is een zeer besmettelijke ziekte van de luchtwegen die veroorzaakt wordt door de bacterie Bordetella pertussis. Het klassieke ziektebeeld begint met een milde hoest, die geleidelijk verergert tot hevige hoestaanvallen gevolgd door een karakteristieke, gierende inademing (‘whoop’ in het Engels). Na één of meerdere maanden verdwijnen de hoestbuien geleidelijk. Complicaties als gevolg van pertussis kunnen zeer ernstig zijn en soms tot de dood leiden. Zuigelingen hebben het grootste risico op ernstige kinkhoest, maar kinkhoest komt voor in alle leeftijdsgroepen. Zowel het ziektebeeld als de ernst van de symptomen lopen uiteen tussen verschillende groepen. Het ziektebeloop van kinkhoest is bijvoorbeeld vaker mild of atypisch in gevaccineerde kinderen, adolescenten en volwassenen.

B. pertussis komt de luchtwegen binnen via minuscule luchtdruppels en hecht zich aan het trilhaarepitheel in de neus-keelholte. Vervolgens onderdrukt de bacterie het afweersysteem van de menselijke gastheer en dringt dieper door in de luchtwegen, naar de trachea en de longen. Dit proces wordt ondersteund door bepaalde factoren die de bacterie aanmaakt. Deze zogenaamde virulentiefactoren zorgen er bijvoorbeeld voor dat de bacterie goed kan aanhechten, en tevens dat afweersysteem van de gastheer wordt onderdrukt. Doordat een besmetting met B. pertussis hoestbuien veroorzaakt, kan de bacterie zich beter verspreiden tussen mensen.

De introductie van vaccins vanaf 1940 zorgde voor een verlaging van de ziektelast en sterfte als gevolg van kinkhoest. De eerste kinkhoestvaccins waren de zogenaamde ‘hele cel’ vaccins (whole-cell in het Engels of wP-vaccins). Deze vaccins bestonden uit met hitte of chemicaliën afgedode en gedetoxificeerde bacteriën. Ondanks dat deze vaccins een goede werkzaamheid hadden, gaven de vaccins ook bijwerkingen in zuigelingen. Daarnaast produceerden veel landen hun eigen kinkhoestvaccins, die niet allemaal even effectief waren. Als gevolg hiervan werden in de jaren negentig acellulaire (aP)-vaccins ontwikkeld en goedgekeurd. In hoge-inkomenslanden hebben deze aP-vaccins sindsdien wP-vaccins vervangen. aP vaccins bevatten één tot vijf gezuiverde B. pertussis antigenen: pertussis toxine (Ptx), pertactine (Prn), filamenteus haemagglutinine (FHA), serotype 2 fimbriae (Fim2) en serotype 3 fimbriae (Fim3). Ondanks dat de introductie van kinkhoestvaccinatie heeft geleid tot een aanzienlijke afname van ziektegevallen en sterfte als gevolg van kinkhoest is er aanzienlijke circulatie van B. pertussis, zelfs in landen met een hoge vaccinatiegraad. In sommige landen is er zelfs sprake van een toename. Er zijn verschillende mogelijke verklaringen voor de persistentie en toename van pertussis, onder andere meer aandacht voor de ziekte, verbeterde diagnostiek, het wegebben van vaccinimmuniteit en het vermogen van de bacterie om zich aan te passen aan de gevaccineerde gastheer.

Een voorbeeld van een aanpassing van de ziekteverwekker is het niet meer aanmaken van Prn. Varianten die geen Prn meer produceren worden ook wel Prn-deficiënte stammen genoemd. Prn is een antigeen dat in veel aP-vaccins wordt gebruikt en men spreekt daarom van vaccin-antigeen deficiënte (VAD) stammen. In dit proefschrift wordt de rol onderzocht van deze VAD stammen in de persistentie en proberen we antwoord te geven op de vraag of VAD stammen een verklaring zijn voor de toegenomen incidentie van pertussis.

Om uitbraken van pertussis te analyseren is het noodzakelijk om specifieke B. pertussis isolaten te typeren. Tegenwoordig gebeurt dat voornamelijk door het vergelijken van patronen van punt mutaties (single nucleotide polymorphisms, SNPs). De SNPs worden meestal geïdentificeerd door de DNA volgorde te bepalen van het hele bacteriële genoom (“whole genome sequencing”, WGS). WGS wordt meestal uitbesteed en de analyse van de resultaten vereist expertise op het gebied van de bioinformatica. In hoofdstuk 2 beschrijven wij de ontwikkeling en toepassing van een vereenvoudigde methode om op basis van SNPs isolaten te typeren, de SNPeX methode. Belangrijke voordelen van deze methode zijn: [1] kosteneffectief, [2] hoge verwerkingscapaciteit (“high througput”), [3] eenvoudig uit te voeren (uitbesteding niet nodig), [4] geen geavanceerdere software nodig en [4] de methode kan direct op klinisch materiaal worden toegepast. Een groot voordeel van deze methode is dus dat er niet gekweekt hoeft te worden. Kweek is weinig gevoelig (levert veel vals-negatieve resultaten op) en duurt 2-3 dagen. Met name bij uitbraken is snelheid van groot belang. We hebben de SNPeX methode vergeleken met de WGS methode waarvoor, respectievelijk, 38 en 2811 SNPs werden gebruikt. Voor deze vergelijking werden 74 wereldwijd verspreide B. pertussis isolaten gekozen. We vonden dat de topologieën van de stambomen geproduceerd door de twee methoden niet wezenlijk verschilden. In conclusie, we ontwikkelden een veelbelovende methode waarmee kosteneffectief, snel en zonder kweek uitbraken geanalyseerd kunnen worden.

In hoofdstuk 3 wordt de opkomst van Prn-deficiënte stammen in zes Europese landen onderzocht. Tussen 2007-2009 werden Prn-deficiënte stammen gevonden in Zweden en Noorwegen, maar niet in Nederland, het Verenigd Koninkrijk, Finland en Denemarken. Opvallend is dat in landen die eerder aP-vaccins introduceerden, zoals Zweden en Noorwegen (respectievelijk 1996 en 1998), er meer Prn-deficiënte stammen werden gedetecteerd dan landen die later aP-vaccins introduceerden, zoals het Verenigd Koninkrijk (2000), Finland (2005) en Nederland (2005). In Nederland werd in 2005 het wP vaccin vervangen door een aP vaccin dat Prn bevatte. Vijf jaar later, in 2010-2012, werden ook in Nederland Prn-deficiënte stammen geïsoleerd. Deze resultaten suggereren een associatie tussen het invoeren van aP vaccins en de opkomst van Prn-deficiënte stammen. De gevonden Prn-deficiënte stammen vertonen veel genetische variatie. Daarnaast bleek de Prn-deficiëntie veroorzaakt te worden door verschillende mutaties, wat erop wijst dat de mutaties onafhankelijk van elkaar in verschillende takken zijn ontstaan. Dit duidt op positieve selectiedruk. Deze bevindingen hebben geleid tot de hypothese dat de verandering van vaccinatie met wP-vaccins naar vaccinatie met aP-vaccins de ‘kosten-baten’ balans heeft veranderd wat betreft Prn-productie door B. pertussis. In een bevolking die grotendeels gevaccineerd is met wP-vaccinatie draagt het niet produceren van Prn relatief weinig bij aan het ontwijken van immuniteit, omdat er nog steeds immuniteit is tegen de honderden tot duizenden andere antigenen op de kinkhoestbacterie. Echter, in het geval van aP-vaccins, is de immuunreactie gericht op slechts één tot vijf antigenen. Daarom kan het niet produceren van één van deze antigenen, zoals Prn, een aanzienlijk selectief voordeel bieden. Deze voordelen wegen in dit geval op tegen het niet produceren van Prn en de biologische rol die Prn speelt in het bevorderen van infectie.

In hoofdstuk 4 beschrijven we de resultaten van een studie in muizen waaruit blijkt dat zowel wP als aP vaccins vergelijkbare bescherming bieden tegen infectie van B. pertussis in de longen. Een groter verschil werd gezien in de bovenste luchtwegen, waarbij wP vaccins betere bescherming bieden tegen infectie dan aP vaccins. Daarnaast bleek ook dat een deel van de kinkhoestbacteriën in de longen geen FHA meer produceerden, als gevolg van een frameshift mutatie in het fhaB gen. Opvallend was dat deze effecten op vermindering van FHA productie sterker waren in aP gevaccineerde muizen dan in wP gevaccineerde muizen. Zowel aP als wP vaccins bevatten FHA. Dit wijst erop dat een brede immuunreactie - zoals opgewekt door wP-vaccins - de ontwikkeling en verspreiding van VAD-deficiënte stammen beter voorkomt. De kinkhoest bacteriën die zowel geen Prn als geen FHA meer produceerden werden niet meer herkend door antistoffen die opgewekt werden door aP-vaccinatie. Deze bevindingen tonen aan dat het effect van vaccinatie op B. pertussis in de neus en de longen verschilt.

Publications

Zeddeman A, van Schuppen E, Kok KE, van Gent M, Heuvelman KJ, Bart MJ, van der Heide HGJ, Gillard J, Simonetti E, Eleveld MJ, van Opzeeland FJH, van Selm S, de Groot R, de Jonge MI, Mooi FR, Diavatopoulos DA. Effect of FHA and Prn on Bordetella pertussis colonization of mice is dependent on vaccine type and anatomical site. PLoS One. 2020 Aug 21;15(8):e0237394. doi: 10.1371/journal.pone.0237394. eCollection 2020. PMID: 32822419 Free PMC article.

Mooi FR, Zeddeman A, van Gent M. The pertussis problem: classical epidemiology and strain characterization should go hand in hand. J Pediatr (Rio J). 2015 Jul-Aug;91(4):315-7. doi: 10.1016/j.jped.2015.02.001. Epub 2015 Feb 20. PMID: 25704450 Free article. No abstract available.

Zeddeman A, Witteveen S, Bart MJ, van Gent M, van der Heide HG, Heuvelman KJ, Schouls LM, Mooi FR. Studying Bordetella pertussis populations by use of SNPeX, a simple high-throughput single nucleotide polymorphism typing method. J Clin Microbiol. 2015 Mar;53(3):838-46. doi: 10.1128/JCM.02995-14. Epub 2015 Jan 7. PMID: 25568442 Free PMC article.

Bart MJ, van der Heide HG, Zeddeman A, Heuvelman K, van Gent M, Mooi FR. Complete Genome Sequences of 11 Bordetella pertussis Strains Representing the Pandemic ptxP3 Lineage. Genome Announc. 2015 Nov 25;3(6):e01394-15. doi: 10.1128/genomeA.01394-15. PMID: 26607899 Free PMC article.

Zeddeman A, van Gent M, Heuvelman CJ, van der Heide HG, Bart MJ, Advani A, Hallander HO, Wirsing von Konig CH, Riffelman M, Storsaeter J, Vestrheim DF, Dalby T, Krogfelt KA, Fry NK, Barkoff AM, Mertsola J, He Q, Mooi F. Investigations into the emergence of pertactin-deficient Bordetella pertussis isolates in six European countries, 1996 to 2012. Euro Surveill. 2014 Aug 21;19(33):20881. doi: 10.2807/1560-7917.es2014.19.33.20881. PMID: 25166348 Free article.

Bart MJ, Zeddeman A, van der Heide HG, Heuvelman K, van Gent M, Mooi FR. Complete Genome Sequences of Bordetella pertussis Isolates BN9N7 and BN92O, Representing Two Predominant Global Lineages. Genome Announc. 2014 Dec 24;2(6):e01301-14. doi: 10.1128/genomeA.01301-14. PMID: 25540342 Free PMC article.