Sara Benito Vaquerizo

Human-induced climate change caused by the emission of contaminant gases has led to a global crisis affecting society and nature all over the world. Therefore, we urgently need solutions to mitigate these emissions and their effects. This requires a radical change on the way we manage our resources, produce and use our products, and treat our wastes. Gasification of biomass and waste into syngas and further microbial conversion of syngas or industrial off-gas to valuable chemicals is envisioned as a promising strategy. In this thesis, using metabolic modeling, I work on a circular approach to produce medium-chain fatty-acids (MCFAs) and alcohols from the upcycling of biomass-derived C1 feedstocks through synthetic microbial communities.

Synthetic microbial communities can expand the range of products obtained by pure cultures on syngas to molecules of longer and different chain lengths. Here, I have constructed metabolic models of single species and of communities to assess the feasibility and potential of these microbial communities for the production of even- and odd-chain fatty acids and alcohols from C1 gases. For that, I have used a battery of computational methods such as Flux balance analysis (FBA), Flux Sampling, community modeling (with FBA, Flux Sampling), model-reconstruction tools, and experimental data from continuous and non-continuous environments.

In chapter 2, we compared the energetic efficiency of the conversion of several C1 feedstocks by several pathways in both, aerobic and anaerobic conditions, being the latter the most efficiency way. Following these observations, we focused on the anaerobic conversion of C1 feedstocks and, in particular, of C1 gases. Acetogens are anaerobic microorganisms that can grow on C1 gases as the sole carbon and energy source. However, their energetic barriers limit their products to small molecules; mainly acetate and ethanol. Thus, the co-cultivation of an acetogen with a microorganism capable of chain elongation, which can grow on the products of acetogenic metabolism, extends the range of products of gas fermentation.

In chapter 3, chapter 4 and chapter 5, a modular approach was followed to establish microbial communities targeting molecules of different chain lengths (even-/odd-chain fatty acids) by the replacement or addition of microbes to the community. In chapter 3, using community modeling, I first modeled a previously established co-culture of the acetogen Clostridium autoethanogenum and the chain-elongator Clostridium kluyveri producing even-chain MCFAs from CO/syngas. In this study I used metabolic modeling to find possible strategies to increase the production of MCFA, and lower the accumulation of acetate. Several genetic interventions for increasing ethanol production in detriment of acetate production by C. autoethanogenum could potentially increase the production of MCFA. Yet, the co-culture presented some limitations, such as the difference in optimal pH between community members, which limited the chain elongation activity in C. kluyveri and, thus, the production of the target products. A solution to this was the replacement of C. autoethanogenum by an acetogen whose optimal pH was similar to the one of the chain-elongating species. For this, we chose Acetobacterium wieringae strain JM, an isolate from our own culture collection. Thus, upon construction of the model of A. wieringae JM, I modeled the co-culture of A. wieringae JM and C. kluyveri to study the feasibility of such co-culture, and its potential to produce even-chain MCFAs (chapter 5).

The next target was the production of odd-chain fatty-acids from syngas. The combination of the construction of the model of Anaerotignum neopropionicum and the experimental observations in chapter 4, led to the identification of key metabolic features and increased understanding of this microbe. A. neopropionicum was shown to produce propionate from ethanol and ethanol/acetate in the presence of CO through the acrylate pathway, the mechanism of which was clarified here. Thus, we hypothesized that the addition of A. neopropionicum to the previous co-culture of A. wieringae JM and C. kluyveri would potentially shift the product range from even- to odd-chain MCFAs due the presence of propionate. To assess the feasibility of this tri-culture, we used community modeling (chapter 5). Model predictions suggested the feasibility of the tri-culture and the partial shift of products from even- to odd-chain MCFAs (chapter 5). Furthermore, the model predicted that CO/H2 ratios < 1 could increase ethanol production, in favour of MCFAs. In chapter 6, I used a model-driven approach for the establishment of a co-culture of C. autoethanogenum and the solventogen Clostridium beijerinckii producing MCFAs from CO2 and H2. Here, I assessed the growth capabilities of two solventogenic species by using metabolic modeling to find a carbon source that could lead to growth together with acetate, since this is the main product produced by C. autoethanogenum. Model predictions suggested lactate as additional carbon source. Subsequent growth experiments with lactate and acetate as co-substrates led to growth of C. beijerinckii producing butyrate and traces of butanol. I then used community modeling to assess the feasibility of the co-culture, which was later established in fed-batch bioreactors. Furthermore, isobutyrate was a newly identified product in this co-culture. Acknowledging the disparity in scope and capabilities of community modeling tools, I concluded the primary work of my thesis by reviewing and assessing the state of art of said tools (chapter 7). Together with my co-authors, I qualitatively evaluated twenty-four tools, and quantitatively tried fourteen of them and assessed their capability to predict case studies of microbial communities of two species. Finally, we identified the strengths, challenges and limitations of these tools and gave a wide range of recommendations for future development of the field. In the general discussion (chapter 8), I discussed the challenges and limitations of using microbial communities for the upcycling of C1 feedstocks, both from the laboratory and computational perspectives. Furthermore, I discussed the future perspectives of this technology and I suggested strategies to overcome their limitations. Resumen El cambio climático, causado por la emisión de gases contaminantes debido a la actividad humana, ha provocado una crisis global que afecta tanto a la sociedad como a la naturaleza a nivel mundial. Por tanto, es necesario encontrar soluciones urgentes para mitigar las emisiones y minimizar sus efectos. En definitiva, se requiere un cambio radical en nuestra forma de gestionar nuestros recursos, utilizar y producir productos, así como en el tratamiento de nuestros desechos. La gasificación de biomasa y residuos en gas de síntesis (syngas), seguida de la conversión microbiana del syngas o de gases industriales en productos químicos valiosos, es una estrategia prometedora. En esta tesis, utilizamos modelos metabólicos de comunidades microbianas sintéticas para estudiar la producción de ácidos grasos de cadena media y alcoholes a partir de la conversión de gases de un carbono. La conversión de syngas mediante el uso de comunidades microbianas sintéticas puede ampliar la gama de productos obtenidos por cultivos de una sola especie. Un ejemplo es la producción de ácidos grasos con cadenas más largas. En este proyecto, he construido modelos metabólicos de especies individuales y de comunidades para evaluar la viabilidad y el potencial de dichas comunidades para producir ácidos grasos y alcoholes de cadena par e impar a partir de gases de un carbono (CO, CO2). Para ello, he utilizado una serie de métodos computacionales como Flux Balance Analysis (FBA), Flux Sampling, community modeling (con FBA y Flux Sampling), herramientas de construcción de modelos y datos experimentales de operaciones en continuo y discontinuo. En el capítulo 2, comparamos la eficiencia energética de la conversión de varias materias primas de un carbono a través de varias rutas metabólicas tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, siendo esta última la forma más eficiente. Siguiendo estas observaciones, nos enfocamos en la conversión anaeróbica de compuestos de un carbono y, en particular, de gases como el CO y CO2. Los acetógenos son microorganismos anaeróbicos que pueden crecer utilizando gases de un carbono como única fuente de carbono y energía. Sin embargo, sus limitaciones energéticas reducen sus posibles productos a moléculas pequeñas, principalmente acetato y etanol. Por lo tanto, el co-cultivo de un acetógeno con un microorganismo capaz de crecer utilizando los productos generados por este microorganismo, puede ampliar la gama de productos en la fermentación de gases de un carbono. En los capítulos 3, 4 y 5, seguimos un enfoque modular para establecer comunidades microbianas dirigidas a producir moléculas de diferentes longitudes de cadena (ácidos grasos de cadena par/impar) mediante la sustitución o adición de microorganismos a la comunidad. En el capítulo 3, modelé una comunidad establecida previamente del acetógeno Clostridium autoethanogenum y el alargador de cadena Clostridium kluyveri que produce ácidos grasos de cadena par a partir de CO/syngas. En este estudio, utilicé el modelado metabólico para encontrar posibles estrategias para aumentar la producción de ácidos grasos de cadena par y reducir la acumulación de acetato. Observamos que varias intervenciones genéticas para aumentar la producción de etanol en detrimento de la producción de acetato por parte de C. autoethanogenum podrían aumentar potencialmente la producción de ácidos grasos en la comunidad. Sin embargo, la comunidad presentaba algunas limitaciones como la diferencia de pH óptimo entre los miembros de la comunidad, lo cual limitaba la actividad de alargamiento de cadena en C. kluyveri y, por lo tanto, la producción de ácidos grasos. Una solución fue la sustitución de C. autoethanogenum por un acetógeno cuyo pH óptimo fuera similar al de C. kluyveri. Para ello, elegimos la cepa JM de Acetobacterium wieringae de nuestra propia colección de cultivos. Así, tras la construcción del modelo de A. wieringae JM, modelé la comunidad de A. wieringae JM y C. kluyveri para ver si la comunidad se podía establecer y si podía producir ácidos grasos de cadena par (capítulo 5). El siguiente objetivo fue la producción de ácidos grasos de cadena impar a partir de syngas. La combinación de la construcción del modelo de Anaerotignum neopropionicum y las observaciones experimentales en el capítulo 4 condujeron a la identificación de características metabólicas clave y a un mayor entendimiento de este microorganismo. Se demostró que A. neopropionicum produce propionato a partir de etanol y etanol/acetato en presencia de CO a través de la vía del acrilato, cuyo mecanismo se aclaró en este trabajo. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la adición de A. neopropionicum a la comunidad previa de A. wieringae JM y C. kluyveri podría potencialmente cambiar el rango de productos de ácidos grasos de cadena par, a ácidos grasos de cadena impar debido a la presencia de propionato. Para evaluar la viabilidad de la comunidad de tres especies utilizamos modelado de comunidades (capítulo 5). Las predicciones del modelo sugirieron la viabilidad de la nueva comunidad y el cambio parcial de productos de ácidos grasos de cadena par a cadena impar (capítulo 5). Además, el modelo predijo que con ratios de CO/H2 < 1, la producción de etanol podría aumentar en favor de una mayor producción de ácidos grasos. En el capítulo 6, el uso de modelos ayudó a establecer una comunidad compuesta por C. autoethanogenum y el solventógeno Clostridium beijerinckii para producir ácidos grasos a partir de CO2/H2. Se evaluaron las capacidades de crecimiento de dos especies solventogénicas utilizando modelado metabólico para encontrar una fuente de carbono que permitiera al solventógeno crecer con acetato, ya que este es el principal producto producido por C. autoethanogenum. Las predicciones del modelo sugirieron el lactato como fuente adicional de carbono al acetato, lo cual se confirmó experimentalmente en C. beijerinckii junto con la producción de butirato y trazas de butanol. A continuación, se construyó un modelo de la comunidad de C. autoethanogenum y C. beijerinckii para estudiar la viabilidad de la comunidad y posteriormente, se estableció en biorreactores operados como batch. El crecimiento de la nueva comunidad en CO2/H2 y lactato condujo a la producción de butirato e isobutirato, un producto que no se había observado previamente en ninguna de las especies de la comunidad. El alcance y capacidades de las herramientas de modelado de comunidades es muy diverso, por lo tanto, esta trabajo de tesis concluyó con la evaluación del estado actual de dichas herramientas (capítulo 7). Junto con otros autores, evaluamos veinticuatro herramientas de forma cualitativa y catorce herramientas de forma cuantitativa comparando las predicciones de las herramientas con resultados de estudios experimentales de comunidades microbianas de dos especies. Finalmente, identificamos las fortalezas, desafíos y limitaciones de estas herramientas y propusimos una amplia gama de recomendaciones para el futuro desarrollo de este campo. En la discusión general (capítulo 8), se han analizado los desafíos y las limitaciones de utilizar comunidades microbianas para la conversión de materias primas de un carbono, tanto desde la perspectiva de laboratorio como computacional. Además, se han evaluado las perspectivas futuras de esta tecnología sugiriendo estrategias para superar dichas limitaciones.