Aziza Hussein

Diethylstilbestrol (DES) is een synthetisch hormoon dat voor het eerst werd voorgeschreven in de periode van de jaren 1940 tot 1970 aan zwangere vrouwen om miskramen en vroeggeboorten te voorkomen, en aan vrouwen in het algemeen voor de behandeling van menstruatieproblemen en kanker. Uit latere studies bleek echter dat deze geclaimde gunstige effecten niet werden waargenomen en dat er zelfs nadelige effecten werden gerapporteerd, zoals heldercellige carcinomen en reproductieve en ontwikkelingstoxiciteit. Hoewel verhoogde niveaus van het endogene hormoon 17β-estradiol (E2) naar verluidt de kans op het ontwikkelen van kanker, zoals borstkanker, verhogen, werden de typische nadelige effecten die voor DES werden waargenomen niet in dezelfde mate gerapporteerd voor E2, hoewel DES structureel vergelijkbaar is met E2 en er wordt gesuggereerd dat DES werkt door de effecten van E2 na te bootsen. Het doel van dit proefschrift was om de verschillen in oestrogeniteit en ontwikkelingstoxiciteit tussen DES en E2 te onderzoeken met behulp van verschillende in vitro en in silico benaderingen, waarbij de nadruk lag op de potentiële rol van mogelijke verschillen in ERα-gemedieerde veranderingen in het onderliggende werkingsmechanisme.

Hoofdstuk 1 geeft achtergrondinformatie ter inleiding van het onderwerp. Daarnaast worden de nadelige effecten gerelateerd aan blootstelling aan DES en de bekende werkingsmechanismen van DES beschreven. De kennislacunes en het hoofddoel van het proefschrift worden gedefinieerd en de te gebruiken teststrategieën worden uitgelegd en er wordt een algemeen overzicht van het proefschrift gegeven.

Hoofdstuk 2 onderzocht de mogelijke verschillen tussen DES en E2 bij de inductie van ERα-gemedieerde cellulaire effecten, waaronder ERα-gemedieerde reportergenexpressie in de U2OS CALUX-assay, ERα-gemedieerde celproliferatie, en ERα-gemedieerde-coregulatorinteracties en genexpressie in cellen van de T47D-borstkankercellijn. De verkregen resultaten geven aan dat DES en E2 ERα-gemedieerde reportergentranscriptie en T47D-celproliferatie op een vergelijkbare manier activeren. Er werden echter kleine maar significante verschillen waargenomen tussen DES- en E2-geïnduceerde binding van de ERα aan coregulatormotieven en in transcriptomische handtekeningen. Deze verschillen, waaronder met name de door E2 geïnduceerde binding van de ERα met verschillende co-repressormotieven, en de door DES geïnduceerde downregulatie van genen die betrokken zijn bij histondeacetylering en DNA-methylering, en upregulatie van CYP26A1 en CYP26B1, kunnen een rol spelen bij de differentiële in vivo effecten die voor DES en E2 worden gerapporteerd. Aldus konden coregulatorbinding en transcriptomische handtekeningen DES van E2 onderscheiden.

In Hoofdstuk 3 werd een alternatieve teststrategie geëvalueerd om de in vivo ontwikkelingstoxiciteit van DES kwantitatief te voorspellen. Hiertoe werd een fysiologisch gebaseerd kinetisch (PBK) model gedefinieerd dat vervolgens werd gebruikt om concentratie-responsuitkomsten voor de in vitro ontwikkelingstoxiciteit van DES, verkregen in de ES-D3-celdifferentiatie-assay, te vertalen naar voorspelde in vivo dosis-responsgegevens voor ontwikkelingstoxiciteit. Eerdere studies toonden aan dat de door het PBK-model gefaciliteerde reverse dosimetry-benadering een nuttige aanpak is om de ontwikkelingstoxiciteit van verschillende ontwikkelingstoxines kwantitatief te voorspellen. De in dit hoofdstuk verkregen resultaten laten zien dat het PBK-model de DES-bloedconcentraties bij ratten adequaat voorspelde. Bovendien onthulde de studie dat DES positief testte in de ES-D3-differentiatie-assay en dat de door DES geïnduceerde remming van de ES-D3-celdifferentiatie kon worden tegengegaan door de oestrogeenreceptor alfa (ERα) antagonist fulvestrant, wat aangeeft dat de in vitro ES-D3-celdifferentiatie-assay in staat was de rol van ERα te simuleren die gerapporteerd is in het werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan de ontwikkelingstoxiciteit van DES in vivo. Ten slotte werden de in vitro gegevens gecombineerd met het PBK-model om een dosis-responscurve te voorspellen voor de in vivo ontwikkelingstoxiciteit van DES, en de resultaten lieten duidelijk zien dat deze combinatie de in vivo ontwikkelingstoxiciteit van DES niet op een kwantitatieve manier adequaat voorspelde. Er werd dan ook geconcludeerd dat, hoewel de EST DES kwalificeert als een ontwikkelingstoxine en de rol van ERα in dit proces detecteert, de ES-D3-celdifferentiatie-assay van de EST blijkbaar niet het volledige werkingsmechanisme achter de door DES geïnduceerde ontwikkelingstoxiciteit in vivo vastlegt. Dit kan deels te wijten zijn aan het feit dat de ES-D3-celdifferentiatie-assay het complexe biologische systeem en de metabole capaciteit van een intact organisme mist en/of dat de assay mogelijk niet alle werkingsmechanismen weerspiegelt die mogelijk ten grondslag liggen aan ontwikkelingstoxiciteit, waaronder bijvoorbeeld epigenetische effecten, waarvan is gerapporteerd dat ze een belangrijke rol spelen bij de ontwikkelingseffecten van DES.

Vanwege deze potentiële beperkingen van de EST werd in Hoofdstuk 4 de ontwikkelingstoxiciteit van DES vergeleken met E2 in de zebravis embryotoxiciteitstest (ZET). Daarnaast werd onderzocht of de rol van de ERα in de door DES gemedieerde ontwikkelingstoxiciteit ook in de ZET kon worden aangetoond. Daartoe werd de in vitro embryotoxiciteit van DES en E2 gekwantificeerd in de ZET in af- en aanwezigheid van de ERα-antagonist fulvestrant. Resultaten verkregen in de ZET lieten zien dat DES groeivertraging, cumulatieve mortaliteit en misvormingen bij zebravissen induceerde, terwijl E2 alleen groeivertraging en cumulatieve mortaliteit vertoonde met een lagere potentie in vergelijking met DES. Bovendien induceerde DES de vorming van pericardiaal oedeem in zebravissen, wat niet werd waargenomen bij aan E2 blootgestelde zebravissen. Dit effect kon worden tegengegaan door co-blootstelling aan fulvestrant, wat aangeeft dat de ZET in staat was de rol van ERα vast te leggen in het werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan dit ontwikkelingstoxiciteitseffect van DES in zebravissen. Over het geheel genomen wordt geconcludeerd dat de ZET onderscheid maakt tussen E2 en DES met betrekking tot hun ontwikkelingstoxiciteit, terwijl de rol van ERα in de specifieke ontwikkelingstoxiciteitseffecten gevonden voor DES wordt bevestigd. Bovendien bleek de ZET, net als de EST, niet in staat de relatief hoge in vivo potentie van DES als ontwikkelingstoxine te vangen.

Ten slotte werd in Hoofdstuk 5 van het proefschrift onderzocht in welke mate verschillen in kinetiek en interne dosisniveaus kunnen bijdragen aan de potentiële in vivo verschillen in effecten van E2 vs DES op de ontwikkeling. Er werd verondersteld dat een deel van de in vivo verschillen zou kunnen voortkomen uit verschillen in de interne dosisniveaus van deze twee oestrogenen tijdens de zwangerschap en/of de DES-behandeling. Om kwantificering van dosisafhankelijke interne dosisniveaus mogelijk te maken, werden fysiologisch gebaseerde kinetische (PBK) modellen voor E2 en DES bij zwangere vrouwen gedefinieerd. De modellen voorspelden dat de kinetiek van DES en E2 bij zwangere vrouwen vergelijkbaar was. Therapeutische doses DES zoals gegeven aan zwangere vrouwen zouden leiden tot bloedspiegels die 3 tot 4 ordes van grootte hoger zijn dan endogene E2-bloedspiegels. Geconcludeerd wordt dat de ontwikkelde PBK-modellen de kwantificering van dosisafhankelijke plasmaconcentraties van DES en E2 bij zwangere vrouwen mogelijk maken en onthullen dat verschillen in effecten van DES en E2 op de ontwikkeling ten minste gedeeltelijk te wijten kunnen zijn aan verschillen in interne blootstellingsniveaus.

In Hoofdstuk 6 wordt een overzicht en discussie van de verkregen resultaten gegeven. Het hoofdstuk presenteert ook de overblijvende lacunes in de gegevens en toekomstperspectieven. Alles bij elkaar wordt geconcludeerd dat de twee oestrogenen E2 en DES verschillen in hun biologische effecten gerelateerd aan de ontwikkeling op een subtiele maar significante manier. Op cellulair niveau vertonen DES en E2 grote overeenkomsten in de moleculaire paden die gerelateerd zijn aan ERα-gemedieerde effecten met kleine significante verschillen die kunnen bijdragen aan de ontwikkelingstoxiciteit, deels via potentiële epigenetische effecten van DES. De in vitro ontwikkelingstoxiciteitsassays EST en ZET kunnen DES onderscheiden van E2 wat betreft ontwikkelingstoxiciteit, maar vangen tegelijkertijd niet het volledige werkingsmechanisme achter de door DES geïnduceerde ontwikkelingstoxiciteit. Ten slotte werd aangetoond dat naast de subtiele verschillen in toxicodynamiek, substantiële verschillen in interne concentraties (endogene E2-concentraties vergeleken met voorspelde DES-concentraties bij vrouwen die DES als medicatie gebruikten) bijdragen aan de differentiële in vivo effecten van E2 en DES.