Andrea Brum

Bot is een dynamisch orgaan dat gedurende het hele leven een constante remodellering ondergaat, gecontroleerd in een evenwichtsoefening tussen verwijdering van oud bot door osteoclasten en vorming van nieuw bot gecontroleerd door osteoblasten, evenals zijn terminaal gedifferentieerde vorm de osteocyt. Het proces van het bouwen van bot begint met de mesenchymale stromale cel (MSC), een multipotente cel die het vermogen heeft om te differentiëren in een aantal celtypen, waaronder osteoblasten, chondrocyten en adipocyten. De afgelopen decennia zijn een aantal sleutelfactoren en signaalroutes vastgesteld die de differentiatie en activiteit van osteoblast beheersen; een beter begrip van het signaalnetwerk, hun ingewikkelde interacties en welke andere genen en routes betrokken zijn bij de osteoblastfunctie is echter vereist om benaderingen te ontwikkelen om de botvorming te verbeteren en fractuurgenezing te bevorderen voor patiënten met aandoeningen zoals osteoporose. Het algemene doel van dit proefschrift was, door een gecombineerd gebruik van bioinformatische, genomische, moleculaire en proteomische benaderingen, om nieuwe factoren (verbindingen, genen en processen) te identificeren die te maken hadden met osteoblastdifferentiatie en botvorming om de basiskennis van osteoblastdifferentiatie uit te breiden welke uiteindelijk kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van een nieuwe botanabole behandeling voor aandoeningen zoals osteoporose.

In de hoofdstukken 2 en 3 is het gebruik van het webgebaseerde Connectivity Map-hulpmiddel (CMap) aangetoond om verbindingen te vinden met correlerende genexpressieprofielen met die van menselijke MSC's (hMSC's) die osteoblastdifferentiatie ondergaan welke de osteoblastdifferentiatie kunnen beïnvloeden. De CMap identificeerde parbendazol als de bovenste positief correlerende verbinding en in hoofdstuk 2 is aangetoond dat parbendazol, onafhankelijk van een extra osteogene stimulus, in vitro humane osteoblastdifferentiatie kon stimuleren zoals bewezen door verhoogde ALP-activiteit, mineralisatie en opregulatie van genen die belangrijk zijn in osteoblast differentiatie en extracellulaire matrixproductie. Mechanistisch is gevonden dat het osteogene effect van parbendazol onafhankelijk van de glucocorticoïdereceptorsignalering optreedt, maar eerder via het beïnvloeden van de vorming van microtubuli, cytoskeletorganisatie, focale adhesieverdeling en BMP2-activiteit. In hoofdstuk 3 zijn drie extra positief gecorreleerde verbindingen geïdentificeerd; metaferine A, calciumfolinaat en amylocaïne, die osteoblast differentiatie en mineralisatie van hMSC's in vitro stimuleren. Omgekeerd zijn ook verbindingen met negatief gecorreleerde gensignaturen met die van differentiërende osteoblasten, waarvan de resultaten waarvan verondersteld is dat ze interessante nieuwe genen en processen in het osteoblastdifferentiatieproces kunnen onthullen onderzocht. Ook zijn drie verbindingen geïdentificeerd, salbutamol, metaraminol en diprophylline, die een gensignatuur vertonen die negatief gecorreleerd is met onze osteogene gensignatuur, maar slechts één van deze geneesmiddelen, salbutamol, remde door dexamethason geïnduceerde osteogene differentiatie van hMSC's. Ten slotte, zijn de de differentieel tot expressie gebrachte genen achter de CMap-geïdentificeerde verbindingen geanalyseerd, en deze benadering gebruikt om twee genen, HMOX1 en STC1, te vinden en te valideren, als belangrijke factoren voor menselijke osteogenese.

In hoofdstuk 4 is CLIC3 geïdentificeerd als een nieuw gen dat specifiek wordt gereguleerd in de osteogene lijn van differentiërende hMSC's. Lentivirale transductie-gemedieerde overexpressie en “silencing” van CLIC3 tijdens osteogenese onthulde een cruciale functie voor CLIC3 bij het bevorderen van osteoblastmineralisatie. Overexpressie van CLIC3 in hMSC's verhoogde de in vivo botvorming sterk in een muismodel voor ectopische menselijke botvorming en benadrukte verder dat CLIC3 een belangrijke rol speelt bij de differentiatie van menselijke osteoblasten. Bioinformatica-analyse van eiwitten, geïdentificeerd door CLIC3-His pull-down suggereert dat CLIC3s rol tijdens osteoblastdifferentiatie gerelateerd kan zijn aan cytoskeletale associaties en signalering, celadhesie en / of nucleaire porievorming of transport doorheen. Ten slotte hebben is vastgesteld dat CLIC3 een interactie aangaat met NEK9 en PTDSS1 tijdens osteoblastdifferentiatie, en remming van de expressie van NEK9 en PTDSS1 vermindert de osteogene differentiatie van hMSC's.

Hoofdstuk 5 beschrijft een nieuwe en in tijd veranderende rol voor Muc1 in botbiologie. Er is aangetoond dat verwijdering van Muc1 bij vrouwelijke muizen leidt tot een verminderd trabeculair botvolume bij 8 weken oude dieren in vergelijking met wildtype (WT) vrouwtjes; dit verschil verdwijnt echter na 16 weken. Tegelijkertijd neemt de snelheid van de endocorticale botvorming en de stijfheid van het dijbeen toe op de leeftijd van 16 weken bij Muc1-/- vrouwelijke muizen, met een hogere snelheid van de endocorticale botvorming tot 52 weken bij de Muc1-/- muizen. Histomorfometrische analyse toonde aan dat femora van 16-weken oude Muc1-/- vrouwelijke muizen lagere aantallen osteoblasten vertoonden langs het botoppervlak, terwijl femora van 8- en 52-weken oude KO- en WT-muizen niet verschilden in hun aantal osteoblasten.

Concluderend heeft dit proefschrift een aantal nieuwe bevindingen op het gebied van botbiologie gepresenteerd en de nadruk gelegd op de complexiteit van de biologie en studie van osteoblastdifferentiatie. Deze onderzoeken, en dergelijke studies, zijn van vitaal belang om meer kennis te vergaren over MSC-besluitvorming en osteoblasten differentiatie, die nodig is om de hoognodige anabole therapeutica te ontwikkelen. De bevindingen in dit proefschrift benadrukken het belang van het cytoskelet bij het reguleren en beïnvloeden van osteoblastdifferentiatie, en kunnen veelbelovend zijn als nieuwe anti-osteoporotische behandelingen, met verder onderzoek. De ontdekking van een aantal nieuwe factoren die de osteoblastdifferentiatie beïnvloeden, waaronder de CMap-geïdentificeerde verbindingen en CLIC3 en MUC1, opent nieuwe wegen op het gebied van botbiologie voor de ontwikkeling van botanabole therapeutica.