Samara Rosendo Machado

Virusoverdracht van een geïnfecteerde naar een naïeve gastheer is cruciaal voor het onderhouden van de virale levenscyclus, maar brengt uitdagingen met zich mee. Virussen hebben verschillende transmissieroutes ontwikkeld om deze uitdagingen te overwinnen. Een voorbeeld van een groep virussen met een interessante transmissieroute zijn virussen die overgedragen worden door bloedvoedende insecten of andere geleedpotigen, zogenaamde arbovirussen (voor arthropod-borne virussen). Deze transmissiecyclus vereist namelijk dat het virus kan repliceren in twee evolutionair verschillende gastheren, insecten en gewervelde dieren. De meeste epidemische arbovirussen worden overgedragen door tropische muggen en komen dan ook vooral voor in tropische en subtropische landen waar deze muggen aanwezig zijn. Maar tegenwoordig zijn sommige van deze virussen, zoals het dengue- (knokkelkoorts) en chikungunyavirus, ook endemisch in gebieden met een gematigd klimaat. Deze ontwikkeling wordt vooral veroorzaakt door de uitbreiding van het leefgebied van vector-muggen door veranderingen in het milieu, klimaatverandering en de toename van reizen en handel.

Transmissie van de dengue- en chikungunyavirussen wordt vooral gedreven door Aedes aegypti, ook wel bekend als de gelekoortsmug. Deze is goed aangepast aan een stedelijk habitat en kan verschillende arbovirusziektes op mensen overdragen. De effectiviteit van deze transmissie is deels afhankelijk van de efficiëntie van arbovirusvermeerdering in de mug. Muggen verkrijgen arbovirussen tijdens een bloedmaal bij een viremisch persoon, waarna de virussen de middendarm infecteren, het muggen-equivalent van de maag. Daarna repliceren de virussen in andere weefsels om uiteindelijk de speekselklieren te bereiken. In dit orgaan vindt verdere virusvermeerdering plaats en worden nieuwe virusdeeltjes in het speeksel uitgescheiden, wat essentieel is voor virusoverdracht op een naïeve menselijke gastheer bij een volgende bloedmaal.

Naast fysieke weefselbarrières, moeten arbovirussen ook afweerreacties overwinnen die in de mug geïnduceerd worden door de infectie. Van de vele verschillende immuunreacties die in insecten bestaan, is het RNA interferentie (RNAi)-mechanisme het best gekarakteriseerd. Dit antivirale verdedigingsmechanisme wordt geactiveerd door de herkenning van replicerend viraal RNA en de productie van kleine RNAs, welke helpen bij de afbraak van viraal RNA om zo virusreplicatie te remmen. Naast het RNAi-mechanisme zijn er aanwijzingen dat transcriptioneel geïnduceerde signaalroutes (zoals Toll, IMD, en JAK-STAT) bijdragen aan de antivirale afweer. Ook zijn er waarschijnlijk andere, momenteel nog onbekende, mechanismes die invloed hebben op de antivirale afweer. Het doel van dit proefschrift is om dit soort mechanismes te ontdekken en karakteriseren.

In hoofdstuk 2 hebben we de expressie van honderden RNA-bindende eiwitten geremd om nieuwe factoren te vinden die een rol spelen in de antivirale afweer van muggen. RNA-bindende eiwitten spelen vaak een belangrijke rol in afweerreacties, en we konden inderdaad drie DEAD-box RNA helicases identificeren, die een breed antiviraal fenotype tegen verschillende arbovirussen lieten zien. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de antivirale functie van één van deze RNA helicases, Dhx15, is vervolgens verder onderzocht. Dhx15 reguleert de expressie van genen die betrokken zijn bij glycolyse, een proces dat een centrale rol speelt in de energiehuishouding van de cel. Interessant was dat chikungunyavirus-infectie leidt tot een soortgelijke verandering in genexpressie, wat suggereert dat Dhx15 virusreplicatie beïnvloedt door de modulatie van de glycolyse cascade.

In hoofdstuk 3 hebben we ons gericht op andere antivirale eiwitten die we hebben geïdentificeerd in de genetische screen uit hoofdstuk 2. Een interessant resultaat was dat vier van deze eiwitten, SPT4, SPT5, SPT6, en Brd4, allemaal een rol spelen in de regulatie van transcriptie, in een proces dat transcriptionele pauzering wordt genoemd. Remming van deze eiwitten zorgde voor een toename van de replicatie van verschillende arbovirussen, waaronder het chikungunyavirus. Gebaseerd op deze bevindingen hebben we de hypothese opgesteld dat virale replicatie een transcriptionele afweerreactie stimuleert, en dat transcriptionele pauzering deze reactie reguleert. Echter, chikungunyavirus-infectie in muggencellen gaf een lagere transcriptionele respons dan we hadden verwacht. Daarnaast behoorden de geïnduceerde genen niet tot de bekende afweermechanismen. In plaats daarvan zagen we een verhoging van de expressie van heat-shock eiwitten, een bekende stressreactie van de cel. Deze stressreactie was afhankelijk van specifieke eiwitten die betrokken zijn bij transcriptionele pauzering, wat suggereert dat dit mechanisme bijdraagt aan de regulatie van de stressrespons na virale infectie.

In hoofdstuk 4 hebben we het werkingsmechanisme van Brd4, één van de factoren die transcriptie reguleert, verder gekarakteriseerd. Dit eiwit is betrokken bij de zogenaamde epigenetische regulatie van genexpressie. Epigenetische regulatie vindt plaats door dynamische veranderingen van histonen, de structurele eiwitcomplexen waar het DNA omheen gebonden is. Hierin heeft Brd4 een belangrijke rol, met name tijdens actieve transcriptie. We hebben gebruik gemaakt van een sterke farmacologische remmer van Brd4, genaamd JQ1+, om de rol van Brd4 in virusinfectie verder te ontrafelen. Het behandelen van muggencellen met JQ1+ resulteerde in dramatische veranderingen in genexpressie. Opvallend hierin was dat vele differentieel gereguleerde genen afhankelijk zijn van de Forkhead box O (FOXO) transcriptie factor voor hun expressie. Het veranderen van FOXO genexpressie en activiteit had een vergelijkbaar effect op virusreplicatie als JQ1+ behandeling. We concluderen daarom dat Brd4 de expressie beïnvloedt van FOXO-afhankelijke genen en dat dit vervolgens de virusreplicatie beïnvloedt.

In hoofdstuk 5 worden de bevindingen van dit proefschrift bediscussieerd in een bredere context. Verder reflecteer ik op de voordelen en uitdagingen van het muggenmodel dat in deze studies is gebruikt en bespreek ik wat er kan worden gedaan om deze studies voort te zetten. Samenvattend geeft dit proefschrift inzicht in nieuwe mechanismes die bijdragen aan de afweer van Aedes aegypti muggen tegen virussen.

Data from all chapters presented in this thesis are stored digitally on an institutional server that is backed-up once a day. Furthermore, the protocols including materials used, the raw data, and analyses were either documented in a physical lab journal, which is available at the department, or on the Radboudumc instance of the electronic lab journal Labguru. In addition, the raw data from the published chapter 2 is fully available open access, adhering to the FAIR principles. Specifically, all RNA-sequencing data are deposited in NCBI Sequencing Read Archive (SRA) under the accession number PRJNA885496. The raw images and numeric data are published as supplemental source data alongside the main manuscript and are accessible from the publishers website. In addition, these data are deposited in DANS-EASY, a depository for open access data operated by the Royal Dutch Academy of Sciences (KNAW) under the digital object identifier 10.17026/dans-ze4-zf72. The sequencing data from the unpublished chapter 3 is also available under the SRA accession number PRJNA885496.