Ufuk Timur

Het onderzoek dat in dit proefschrift wordt beschreven, is gericht op het verkrijgen van nieuwe inzichten in nieuwe strategieën om de ‘kniegewrichtskwaliteit’ te verbeteren op cellulair, weefsel- of totaal kniegewrichtsniveau.

Focale kraakbeendefecten kunnen leiden tot een inferieure kwaliteit van het kniegewricht als gevolg van verstoorde gewrichtsbiomechanica. Een verstoring in de gewrichtsbiomechanica kan leiden tot een verhoogde inflammatoire intra-articulaire omgeving, wat uiteindelijk kan leiden tot artrose. Daarom hebben we moleculaire mechanismen geëvalueerd die betrokken zijn bij de fenotypische verbetering van menselijke articulaire chondrocyten. De verkregen wetenschappelijke inzichten kunnen leiden tot verbeteringen in celgebaseerde kraakbeenherstelstrategieën en het verbeteren van de kwaliteit van het kniegewricht. In Hoofdstuk 2 hebben we aangetoond dat het kweken van menselijke articulaire chondrocyten onder zuurstofspanning die sterk lijkt op hun fysiologische in vivo omgeving, de expressie van collageen type II via TGF-β verhoogt. Behalve dat het hypoxisch is, wordt kraakbeen over het algemeen ook als hyperosmotisch beschouwd. De betrokkenheid van de TGF-β pathway bij de verbetering van het chondrocytfenotype onder hypoxische condities heeft ons ertoe aangezet om ook de rol ervan onder hyperosmotische condities te onderzoeken in Hoofdstuk 3. We konden een verbeterd chondrocytfenotype onder hyperosmotische condities bevestigen. Interessant is dat hyperosmotische omstandigheden ook het meest de TGF-β2-mRNA-expressie verhoogden, wat in overeenstemming was met onze experimenten onder hypoxische omstandigheden. Dit kan erop wijzen dat van de drie TGF-β-isovormen, TGF-β2 een prominente rol speelt bij het reguleren van het chondrocytfenotype onder hyperosmotische en hypoxische omstandigheden.

Inflammatoire processen zijn in verband gebracht met een verhoogde afbraak van kraakbeen. Het verkrijgen van inzicht in de rol van deze inflammatoire processen voor de kwaliteit van het kniegewricht kan belangrijke aanwijzingen opleveren voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën gericht op kraakbeenherstel. In Hoofdstuk 4 hebben we laten zien dat de afgifte van prostanoïden door het Hoffa’s vetlichaam (HFP) van artrosepatiënten gemiddeld hoger was dan de afgifte van prostanoïden door HFP van patiënten met een kraakbeendefect. De afscheiding van prostanoïde subtypen uit de HFP van patiënten met knieartrose toonde een verdeling over 2 artrose-subgroepen. Bovendien was de COX-2-remmer celecoxib in staat om de PGE2-afgifte door HFP met ten minste 80% te verminderen. Tevens was celecoxib in staat om de expressieverhouding van M1/M2 macrofagenmarkers te veranderen naar een gunstiger M2 fenotype, het meest effectief in HFP-weefsel met hogere prostanoïde-afgifte. Dit geeft aan dat het vermogen van celecoxib om de expressie van markers die zijn geassocieerd met M2-macrofagen in HFP-weefsel te beïnvloeden afhankelijk is van de hoeveelheid aanwezige inflammatie.

De gewrichtshomeostase kan worden verstoord en de kwaliteit van het kniegewricht kan worden aangetast bij een ontstoken kniegewricht. Om dit tegen te gaan, kunnen verschillende methoden worden gebruikt. Een intra-articulaire toediening kan een effectieve methode zijn, aangezien dit betekent dat het medicijn direct in contact komt met de verschillende kniegewrichtsweefsels. In Hoofdstuk 5 hebben we het bewijs voor mogelijke in vivo chondroprotectieve acties van ontstekingsremmende selectieve COX-2 remmers onderzocht. We hebben het gebruik van selectieve COX-2 remmers systemisch of intra-articulair beoordeeld. Uit deze review werd duidelijk dat directe intra-articulaire toediening een effectievere manier kan zijn om selectieve COX-2 remmers te gebruiken om de gewrichtskwaliteit te verbeteren in vergelijking met systemische toediening.

Een drug delivery systeem (DDS) kan bijwerkingen als gevolg van een systemische behandeling omzeilen, waardoor een langere lokale verblijftijd van het medicijn mogelijk is, de therapietrouw van de patiënt toeneemt en frequente intra-articulaire injecties worden vermeden. In deze context kan het gebruik van een ‘slim’ DDS waarin de medicijnafgifte reageert op het ziekteproces, een effectief middel zijn om de kwaliteit van het kniegewricht te verbeteren bij gewrichtspathologieën zoals bijvoorbeeld knieartrose. In Hoofdstuk 6 hebben we het gebruik van celecoxib-geladen polyesteramide (PEA) microsferen onderzocht als een ‘slim’ intra-articulaire DDS bij artrosebehandeling. PEA-microsferen vertoonden een goede intra-articulaire biocompatibiliteit en werden afgebroken in een in vivo OA-model. De afbraak van PEA-microsferen was significant hoger in een inflammatoire omgeving, terwijl het laden van de microsferen met celecoxib de PEA-afbraak verminderde, wat zou kunnen wijzen op een DDS met auto-regulerend gedrag.

In Hoofdstuk 7 stelden we de hypothese op dat de synoviale vloeistof uit het kniegewricht, die in contact is met belangrijke intra-articulaire weefsels, een veelbelovende lichaamsvloeistof vertegenwoordigt om inzichten te verkrijgen in de homeostatische toestand van het hele kniegewricht. We hebben een vergelijkende volledige proteoomanalyse uitgevoerd van de synoviale vloeistof van artrosepatiënten versus niet-artrosepatiënten, evenals van de eiwitsecretomen van HFP, synovium, meniscus en gewrichtskraakbeen van knieën met OA. We identificeerden verschillende eiwitsoorten met een weefseltype-afhankelijke afgifte en toonden ook hun OA-specificiteit aan. Onze bevindingen in Hoofdstuk 7 benadrukten de aanwezigheid van weefseltype-afhankelijke afgifte van OA-specifieke eiwitten in synoviaal vocht van het kniegewricht van OA-patiënten.

Samenvattend demonstreren onze bevindingen gepresenteerd in dit proefschrift nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de verbetering van het chondrocytfenotype na hyperosmotische en hypoxische culturen en demonstreren ze het belang van de TGF-β pathway in het chondrocytfenotype. Bovendien levert de HFP van patiënten met gewrichtspathologieën zoals kraakbeendefecten en knieartrose een substantiële bijdrage aan het gehalte aan prostanoïden in gewrichtsvloeistof. Het behandelen van pathologieën in het kniegewricht door middel van intra-articulaire injecties in plaats van systemische toediening van medicijnen kan effectiever zijn bij het verbeteren van de homeostase van het kniegewricht. Celecoxib is, geïnjecteerd als een bolus medicijn of geïncorporeerd in een slim DDS, zoals PEA-microsferen, een aantrekkelijke nieuwe strategie om de gewrichtshomeostase te verbeteren. Tot slot hebben we weefseltype-afhankelijke afgifte van OA-specifieke eiwitten in het synoviale vocht van het kniegewricht aangetoond. Deze eiwitten kunnen worden gebruikt als biomarkers om te helpen bij het ontwikkelen van behandelingsstrategieën om de gewrichtshomeostase te verbeteren voor kraakbeenherstelstrategieën of om knieartrose te vertragen.

Concluderend zullen de bevindingen die in dit proefschrift zijn gepubliceerd over het verkrijgen van inzichten in het verbeteren van de kwaliteit van het kniegewricht op cellulair-, weefsel- en gewrichtsniveau bijdragen aan ons begrip van gewrichtspathologieën zoals knieartrose en zal naar verwachting helpen bij het ontwikkelen van strategieën om deze te behandelen.

Türkçe Özet

Bu tezde sunulan araştırmanın amacı; hücresel, doku veya eklem seviyesinde 'diz eklemi kalitesini' geliştirmek için kullanılacak olan yeni stratejiler için yeni öngörüler ve kazanımlar elde etmektir. Fokal kıkırdak defektleri bozulmuş eklem biyomekaniği ve düşük diz eklemi kalitesine neden olabilmekte ve eklem içi artan bir inflamatuar ortama yol açabilmektedir. Bu artan inflamatuar ortam, osteoartrit diye tabir ettiğimiz bir eklem hastalığına neden olmaktadır. Dolayısıyla bu çalışma, insanlardaki kıkırdak hücrelerin fenotipik gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmalar üzerine odaklanmaktadır. Bu üretilen bilginin hücre bazlı kıkırdak onarım stratejilerinde ve tedavi sonrası diz eklemi kalitesini iyileştirmede yardımcı olması bekleniyor. Tezin İkinci Bölümünde, kıkırdak hücrelerinin, kıkırdağın insan vücudundaki fizyolojik olarak görülen hipoksik oksijen gerilim oranıyla kültüre edilmesiyle ilgili bilgilere yer verilmektedir. Bu araştırmalar neticesinde, kıkırdak hücrelerinde, kıkırdak dokusunda önemli bir protein olan kolajen tip II ekspresyonunun iyileştiği gözlemlenmiş ve bu iyileştirmede TGF-β proteininin önemli bir rol üstlendiği tespit edilmiştir.

Kıkırdak hipoksik olmanın yanı sıra genellikle hiperozmotik olarak değerlendirilir. TGF-β proteininin hipoksik gerilim ortamında kıkırdak hücrelerindeki fenotipik gelişimindeki rolü, bizleri Tezin Üçüncü Bölümünde bahsedilen, bu proteinin hiperosmotik ortamlarında kültüre edilmiş kıkırdak hücrelerin fenotipik gelişimindekini rolünü araştırmaya teşvik etmiştir. Bu amaçla öncelikle, hiperosmotik ortamlarında kültüre edilmiş kıkırdak hücrelerindeki fenotipik gelişimi doğrulanmıştır. İlginç bir şekilde, tıpkı hipoksik koşullarda kültüre edilmiş kıkırdak hücrelerinde gözlemlediğimiz gibi, hiperozmotik koşullar da en belirgin şekilde artan TGF-β2 mRNA ekspresyonu olduğu gözlemlenmiştir. Bu bulgu, üç TGF-β izoformu arasında, TGF-β2 izoformunun kıkırdak hücrelerindeki fenotipik gelişiminde önemli bir rol aldığını gösterebilir.

Kıkırdak hasarları inflamatuar bir ortam ile ilişkilendirilmiştir. Bu inflamatuar ortamın diz eklemi kalitesine etkisini araştırmak, yeni kıkırdak onarım tedavileri geliştirmek için önemli ipuçları verebilir. Tezin Dördüncü Bölümünde bahsedildiği üzere, osteoartrit hastaların Hoffa yağ yastığı tarafından salgılanan prostanoid oranının, kıkırdak defekt hastaların Hoffa yağ yastığından salgılanan prostanoid oranından, daha yüksek olduğu görülmüştür. Araştırmalarımızda, osteoartrit hastaların Hoffa yağ yastığından salgılanan prostanoid oranının 2 alt gruba ayrıldığı da gözlemlenmiştir. Ayrıca, COX-2 inhibitörü selekoksib, Hoffa yağ yastığı tarafından prostanoid salınımını en az %80 oranında etkili bir şekilde azaltabilmiştir. Ek olarak, selekoksib M1/M2 makrofaj ekspresyon oranını daha uygun olan M2 fenotipine yönlendirmiştir. Bu M2 fenotipine en etkili yönlendirmenin, prostanoid salınımı yüksek olan Hoffa yağ yastıklarında olduğu gözlemlenmiştir. Bu bulgu, selekoksibin, M2 makrofajları ile ilişkili olan gen ekspresyonuna yönlendirme kapasitesi, Hoffa yağ yastığında inflamasyon oranına bağlı olduğunu gösterebilir.

Eklem homeostazı bozulabilir ve inflamasyon oranı yüksek olan bir diz ekleminde diz eklem kalitesi düşebilir. Bununla mücadele etmek için farklı yöntemlerden yararlanılabilir. Eklem içi bir enjeksiyon etkili bir araç olabilir, çünkü bu, ilacın farklı diz eklem dokuları ile doğrudan temas halinde olacağı anlamına gelecektir. Tezin Beşinci Bölümünde, sistematik bir derleme ile selektif COX-2 inhibitörlerin potansiyel in vivo kondroprotektif etkileriyle ilgili araştırma bilgilerine yer verilmektedir. Bu sistematik derlemede selektif COX-2 inhibitörlerin sistemik veya eklem içi kullanımı incelenmiştir. Bu sistematik derlemeden elde edilen bulgular, selektif COX-2 inhibitörlerin sistemik tedaviye nazaran, eklem içi bolus bir ilaç veya bir ilaç dağıtım sistemine dahil edilmiş olarak kullanıldığında, eklem kalitesini geliştirmek için daha etkili olabileceğini göstermektedir. Eklem hastalıklarında tedavi için, kontrollü bir ilaç salım sistemi daha avantajlı olabilir. Kontrollü ilaç salım sistemi, sistemik tedaviyle ilişkili yan etkilerin üstesinden gelebilir. Ayrıca kontrollü ilaç salım sistemi, ilacın eklem içinde daha uzun kalması, hastanın kullanımından kaynaklı ilaç kaybının engellenmesi ve gerek duyulan eklem içi enjeksiyonları minimum seviyesine indirmesi gibi avantajları vardır. Bu bağlamda, eklem içinde meydana gelen patolojik bulgulara ilaç salımı ile cevap verebilme yeteneği olan ‘akıllı’ bir kontrollü ilaç salım sistemi, osteoartrit gibi bir diz eklem hastalığında bir avantaj getirebilir. Tezin Altıncı Bölümünde, selekoksib yüklü polyesteramid (PEA) mikrokürelerin osteoartrit tedavisinde eklem içi ‘akıllı’ bir kontrollü ilaç salım sistemi olarak uygulanabilirliği ile ilgili araştırma bilgilerine yer verilmektedir. Bu PEA mikroküreler, eklem içi biyouyumluluk gösterdi ve in vivo bir osteoartrit laboratuvar hayvan modelinde eklem içi degradasyon göstermiştir. PEA mikrokürelerinin degradasyonu, inflamatuar bir ortamda daha yüksekken, mikroküreleri selekoksib ile yüklemek degradasyonu azaltmıştır. Bu bulgular, PEA mikrokürelerin otoregulasyon davranışı gösterebileceğine dair bir işarettir.

Tezin Yedinci Bölümünde, diz eklemi içinde bütün dokular ile temas halinde olan sinovyal sıvısının, diz ekleminin homeostatik durumu hakkında bilgi edinmek için umut verici bir sıvı olduğuna dair bir hipotez geliştirilmiştir. Hem osteoartrit hastaların, hem osteoartrit hastalığı olmayan bireylerin sinovyal sıvılarında proteomik analizlerimizin yanı sıra, Hoffa'nın yağ yastığı, sinovyum, menisküs ve eklem kıkırdağının sekretomlarında proteom analizleri gerçekleştirilmiştir. Analizlerde doku-spesifik proteinler bulunmuştur ve bu proteinlerin OA-spesifik özellikleri olduğu gösterilmiştir. Bulgularımız, osteoartrit diz ekleminin sinovyal sıvısında doku-spesifik ve osteoartrite özgü proteinlerin varlığını göstermiştir.

Toplu olarak, bu tezde sunulan bulgular, hiperozmotik ve hipoksik kültürlerden sonra kıkırdak hücrelerdeki fenotip gelişiminde rol alan moleküler mekanizmalarda yeni anlayışlar göstermekte ve kıkırdak hücrelerin fenotipinde TGF-β’nin önemli rol oynadığını belirtmektedir. Sinovyal sıvıda bulunan prostanoid içeriğine, kıkırdak defektleri ve osteoartrit gibi eklem patolojileri olan hastaların Hoffa yağ yastığının önemli bir katkısı vardır. İlaçların sistemik uygulanması yerine, eklem içi enjeksiyonlar yoluyla diz ekleminin hedeflenmesi, diz eklemi homeostazını iyileştirmede daha etkili olabilecektir. Ayrıca, bolus ilaç olarak enjekte edilen veya akıllı bir ilaç salım sistemine dahil edilen selekoksib, osteoartrit gibi eklem hastalıklarının tedavisi için çekici bir yeni stratejidir. Son olarak, diz eklemi sinovyal sıvısında osteoartrite özgü proteinlerin doku tipine bağlı salınımı gösterilmiştir. Bu proteinler, kıkırdak onarım stratejileri için eklem homeostazını iyileştirmek veya osteoartriti yavaşlatmak için tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olmak için biyobelirteçler olarak kullanılabilir.

Birlikte ele alındığında, bu tezde yayınlanan ve hücresel, doku ve total eklem seviyesinde sunulan ve diz eklemi kalitesinin geliştirebilecek yeni bulgular, osteoartrit gibi eklem patolojilerini anlamamıza katkıda bulunacaktır ve bu eklemleri tedavi etmek için stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.