Zhang Chujun

In dit proefschrift hebben we de vorming van twee stress-assemblages, Sec-lichaampjes en stresskorrels, behandeld als reactie op stress in Drosophila S2-cellen, hetzij door aminozuuruithongering in KRB (Krebs Ringer-bicarbonaatbuffer) of door hoge NaCl-stress (SCHN). Zowel Sec-lichamen als stresskorrels zijn fasegescheiden membraanloze organellen (MLO's). Het is interessant dat ze zich tegelijkertijd met dezelfde kinetiek kunnen vormen bij de incubatie in KRB en SCHN, maar toch verschillend kunnen blijven zonder significante vermenging. Verder hebben we Sec-lichaamscomponenten geïdentificeerd met behulp van proximity-labeling en massaspectrometrie.

Hoofdstuk 1 introduceert de belangrijkste concepten die in dit proefschrift worden behandeld, inclusief de vorming van membraanloze organellen onder stress. Sec-lichamen vormen door samensmelting van ER-uitgangsplaatsen (ERES) componenten, en stresskorrels vormen door samensmelting van specifieke RNA-bindende eiwitten en RNA's. Membraanloze organellen compartimenteren het celcytoplasma naast membraangebonden compartimenten.

In Hoofdstuk 2 hebben we, naar aanleiding van de vondst van Sec-lichaampjes uit componenten van een membraancompartiment ERES, de relatie tussen celfasescheiding en membraan verder onderzocht. Hoewel de term "membraanloos organel" taalkundig correct is en een compartiment definieert dat niet wordt afgesloten door een lipidisch membraan, verwijst het ook naar het idee dat fasescheiding in een cellulaire context "niets te maken heeft" met membraan. Dit is in feite niet het geval. Veel MLO's vormen zich dicht bij elkaar of zelfs met het membraan als sjabloon. Daarom moet de term membraanloze organellen worden vervangen door niet-membraangebonden condensaten/assemblages/compartimenten. Bovendien moet het contact tussen deze samenstellingen en het membraan op een meer systematische manier worden gedefinieerd, omdat ze elkaars biologie beïnvloeden. P-lichamen lijken zich te vormen in de buurt van het ER, ook Sec-lichamen. Hoe zit het met andere condensaten, aangezien het ER de hele cel doordringt? Ten slotte wordt een grote hoeveelheid gegevens die leiden tot een diep begrip van de biofysische en materiële eigenschappen van deze condensaten in vitro uitgevoerd met behulp van gezuiverde eiwitten. Aangezien de cel echter een omgeving is vol met membraangebonden organellen die interageren met condensaten, is dit een goed moment om membraan toe te voegen aan in vitro fasescheidingsexperimenten.

In Hoofdstuk 3 hebben we de signaalroutes geïdentificeerd die Sec-lichaamsvorming veroorzaken en we hebben vastgesteld dat twee routes cruciaal zijn. De eerste is de activering van door zout induceerbare kinasen (SIKs; SIK2 en SIK3 in Drosophila) door Na+-stress, wat voldoende is wanneer deze hoog is (d.w.z. een Na+-concentratie die 4 keer hoger is dan in het groeimedium). De tweede is activering van twee kinasen IRE1 en PERK (ook bekend als PEK in vliegen) stroomafwaarts van ER-stress veroorzaakt door de afwezigheid van aminozuren. Deze activering alleen is niet voldoende om tot Sec-lichaamsvorming te leiden. Het moet worden gecombineerd met matige zoutstress om Sec-lichaamsvorming te veroorzaken.

Interessant is dat uithongering van aminozuren in KRB en een hoog zoutgehalte beide leiden tot de vorming van een andere stressgroep, de stresskorrels, waarin mRNA's en RNA-bindende eiwitten worden opgeslagen (Hoofdstuk 4). We ontdekten echter dat de vorming van deze tweede spanningsassemblage niet stroomafwaarts is van dezelfde kinasen als Sec-lichamen. Remming van SIK, IRE1 en PERK heeft inderdaad geen invloed op de door KRB en SCHN geïnduceerde vorming van stresskorrels. In plaats daarvan ontdekten we dat osmotische stress door de toevoeging van verschillende zouten of sucrose leidt tot de vorming van stresskorrels en dit wordt gedeeltelijk gemoduleerd door calmoduline-activering, in schril contrast met Sec-lichaamsvorming. Dit zou gedeeltelijk kunnen verklaren waarom the twee assemblages van elkaar gescheiden blijven.

In Hoofdstuk 5 hebben we het Sec-lichaamsproteoom geïdentificeerd door middel van proximity-labeling met behulp van het ascorbaatperoxidase APEX2. We hebben APEX2 gefuseerd met Sec24AB, de COPII-subeenheid die lokaliseert naar ERES in cellen in basale omstandigheden (Schneiders') en met Sec-lichamen in KRB. In aanwezigheid van biotine-fenol en H2O2 (APEX aan), vergemakkelijkt APEX2 de overdracht van een biotine-eenheid naar nabijgelegen interactoren van chimere Sec24AB. Met behulp van een onbevooroordeelde benadering waarbij APEX aan en uit (-H2O2) in SCH en KRB werd vergeleken, identificeerden we 52 specifiek verrijkte Sec-lichaamscomponenten. Dit omvatte een groot deel van de ER- en Golgi-eiwitten. Na validatie door immunofluorescentiemicroscopie van endogene eiwitten, laten we zien dat de expressie van deze componenten niet transcriptioneel en translationeel gereguleerd is. In plaats daarvan lijken ze samen te smelten in Sec-lichamen onder stress vanwege hun hoge gehalte aan intrinsiek ongeordende regio's.

In Hoofdstuk 6 bediscussiëren we onze bevindingen en suggereren directies voor toekomstig onderzoek.

List of publications

Zhang C, Rabouille C. Membrane-bound meet membraneless in health and disease. Cells, 2019, 8(9): 1000.
Zhang C, van Leeuwen W, Blotenburg M, et al. Activation of IRE1, PERK and salt-inducible kinases leads to Sec body formation in Drosophila S2 cells. Journal of Cell Science, 2021, 134(17): jcs258685.
Zhang C, Grond R, Damen J M A, et al. Osmotic stress via calmodulin lead to the formation of stress granule in Drosophila S2 cells. bioRxiv, 2022.
Zhang C, Damen JMA, Grond R, et al. Novel components of the stress assembly Sec body identified by proximity labelling. Submitted to Journal of Cell Biology, 2022.