Ruby Lieshout

Cholangiocarcinoom (CCA) is een heterogene maligniteit van de galwegen. Het is een zeldzame vorm van kanker, met een incidentie van 0,3-6 per 100.000 personen wereldwijd, en heeft een zeer slechte prognose waarbij slechts 7-20% van de patiënten 5 jaar na diagnose nog in leven is. Eén van de factoren die leidt tot dit sombere vooruitzicht is de snelle tumoruitbreiding van de ziekte. Op het moment van diagnose is de ziekte vaak al uitgebreid, hetzij lokaal (in de intra- of extrahepatische galwegen) of op afstand, waardoor curatieve chirurgische interventie niet meer mogelijk is. Naast beperkingen door de anatomische presentatie speelt de inter- en intra-tumor heterogeniteit een belangrijke rol. De heterogene samenstelling van de tumor en aanzienlijke chemoresistentie zorgen ervoor dat systemische behandeling vaak niet effectief is.

De ontwikkeling van doelgerichte therapie en de introductie van immunotherapie hebben gezorgd voor verbeteringen in de behandeling van kanker in de afgelopen decennia. Doelgerichte systemische therapie richt zich op het doden van kankercellen op basis van hun moleculaire afwijkingen en immunotherapie is er op gericht het immuunsysteem van de patiënt zelf te activeren om de kankercellen te doden. Beide methoden zijn veelbelovend voor de behandeling van CCA. Voor succesvolle toepassing in de kliniek is accurate patiënt stratificatie essentieel gebleken. Bij dit proces wordt een bepaalde behandeling gekozen gebaseerd op de specifieke karakteristieken van de tumor bij de patiënt. Het testen van het complete spectrum van veelbelovende nieuwe medicijnen in klinische studies is zeer kostbaar en tijdrovend, en wordt beperkt door de zeldzaamheid van de ziekte, zeker wanneer stratificatie nodig is. Een patiënt-specifiek, tumor-representatief en schaalbaar in vitro model is nodig om dit proces te versnellen. Hierdoor zal het mogelijk worden in het laboratorium het effect van verschillende medicijnen te testen alvorens de patiënt bloot te stellen aan een behandeling.

Patiënt-specifieke CCA organoïden gekweekt uit tumorweefsel zijn recent ontwikkeld en bieden een innovatief CCA in vitro model. Deze organoïden zijn schaalbaar en 3-dimensionaal (3D), en representeren in belangrijke mate de histopathologie, mutaties en genexpressie profielen van het epitheliale kankercel compartiment van de patiënttumor. CCA organoïden zijn geschikt voor het screenen van medicijnen en het identificeren van biomarkers voor therapiegevoeligheid. Het CCA organoïd model staat echter nog in de kinderschoenen. Met de huidige techniek is het slechts mogelijk om voor ongeveer een derde van de CCA patiënten organoïden te initiëren. Ook zijn veel toepassingen nog niet onderzocht. Het model zou bijvoorbeeld gebruikt kunnen worden bij het bestuderen van therapieresistentie, en inter- en intra-tumor heterogeniteit. Belangrijk is om op te merken dat CCA organoïden enkel de epitheliale kankercel component van de tumor presenteren, terwijl het CCA in de patiënt een complexe en uitgebreide tumor micro-omgeving heeft, onder meer bestaande uit kanker-geassocieerde fibroblasten, immuuncellen, endotheelcellen en een collageneuze stromale omgeving. Het doel van het onderzoek in dit proefschrift is daarom om nieuwe toepassingen van het CCA organoïden model te ontwikkelen in de zoektocht naar therapeutische aanknopingspunten, en het CCA organoïd model uit te breiden met de immuuncel en tumor-specifieke stroma componenten van de tumor micro-omgeving.

Gal als bron van CCA organoïden
CCA organoïden kunnen momenteel worden gecreëerd uit chirurgisch verwijderd tumorweefsel of tumorbiopten. Aangezien slechts 20-30% van de CCA patiënten een resectie ondergaat, en een histologisch biopt een invasieve techniek is met bijbehorende risico’s, zou een alternatieve bron voor CCA organoïden waardevol zijn. In hoofdstuk 2 wordt beschreven hoe organoïden kunnen worden gemaakt uit cellen in gal verkregen uit de galwegen tijdens diagnostische en therapeutische ingrepen en uit de galblaas. Deze organoïden vertonen karakteristieken passend bij een oorsprong uit de galwegen buiten de lever. Aangezien eerder aangetoond is dat CCA cellen ook in gal detecteerbaar zijn, zou deze methode in de toekomst een veelbelovend alternatief kunnen zijn als bron voor CCA organoïden, in het bijzonder voor tumoren in de galwegen buiten de lever. Deze vorm van monstername is minimaal invasief, waardoor CCA organoïden eenvoudig op meerdere tijdstippen zouden kunnen worden gekweekt om de tumor en zijn therapiegevoeligheid zo gedurende het ziekteproces te volgen.

Nieuwe toepassingen van CCA organoïden voor het ontdekken van nieuwe therapeutische aanknopingspunten
De uitgebreide heterogeniteit in moleculaire afwijkingen van het CCA vraagt om stratificatie van patiënten bij het bepalen van de meest effectieve therapie. Stratificatie is momenteel alleen gebaseerd op genetische afwijkingen in de tumor. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van succesvolle doelgerichte therapieën, maar zelfs na preselectie van patiënten op basis van mutaties, zijn deze middelen slechts effectief in ongeveer een derde van de patiënten. In hoofdstuk 3 wordt kinoom profilering toegepast om de activiteit van een grote groep kinases te bepalen, met als doel de stratificatie van patiënten te verbeteren en nieuwe therapeutische aanknopingspunten te vinden. Kinase activiteitspatronen in CCA organoïden zijn divers, waardoor zowel individuele als meer algemene kinases als potentiële behandelopties worden geïdentificeerd. Correlatie analyse tussen kinase activiteit en gevoeligheid voor de kinase remmer, toont aan dat sommige remmers verbonden zijn met de activiteit van de kinase die zij remmen, en anderen juist correleren met onverwachte kinases. Kinoom profilering is een veelbelovende techniek voor stratificatie die in toekomstige studies gevalideerd dient te worden.

Primaire scleroserende cholangitis (PSC) is een chronische fibrotische inflammatoire aandoening die in 9-20% van de patiënten leidt tot de ontwikkeling van CCA. In hoofdstuk 4 worden CCA organoïden gebruikt om de invloed van PSC-gerelateerde inflammatoire cytokines op de proliferatie van CCA tumorcellen te onderzoeken. Het blijkt namelijk dat tumorcellen in PSC-CCA sneller prolifereren dan in sporadische CCA. IL-17A heeft een direct proliferatie-inducerend effect op de CCA organoïden. Eerdere studies tonen aan dat deze cytokine bijdraagt aan tumor progressie en therapie resistentie. IL-17A zou daarmee een interessant doelwit kunnen zijn voor de behandeling van CCA.

Verbeteren van het CCA organoïd model door toevoeging van tumor micro-omgeving componenten
Het huidige CCA organoïd model bevat enkel de epitheliale tumorcel component. Hoewel dit onderzoek naar het directe effect van factoren op tumorcellen faciliteert, missen er belangrijke componenten van de tumor micro-omgeving die de respons kunnen moduleren. In hoofdstuk 5 wordt een co-cultuur methode beschreven voor CCA organoïden en immuuncellen die zijn geïsoleerd uit humaan bloed. Zowel directe cel-cel interactie, als indirecte effecten via oplosbare factoren geproduceerd door de immuuncellen, zijn kwantificeerbaar en tonen variatie tussen verschillende CCA organoïd lijnen. Dit model van de interactie tussen immuuncellen en tumorcellen kan preklinisch onderzoek naar anti-tumor immuniteit en immunotherapie in CCA faciliteren.

In hoofdstuk 6 staat het samenspel tussen de extracellulaire matrix (ECM) en de CCA cellen centraal. Tot nu toe werden CCA organoïden gekweekt in een algemeen gebruikte basaal membraan hydrogel die noch de fysieke eigenschappen, noch de matrix componenten van de ECM in een CCA reflecteert. Daarom worden CCA organoïden in dit hoofdstuk gekweekt in gedecellulariseerde CCA en tumor-vrije lever ECM. Hierbij zien we dat gen expressie patronen van CCA organoïden in de CCA ECM meer overeen komen met de tumor in de patiënt dan organoïden die gekweekt worden in de traditionele kweekmethode. Ook induceert kweek in de CCA ECM meer chemoresistentie voor het in CCA patiënten gebruikte middel gemcitabine. Wanneer de CCA organoïden in de tumor-vrije lever ECM worden gekweekt, produceren zij collagenen, waarmee ze zelf de stijve fibreuze omgeving creëren waarin CCA tumorcellen floreren.

Conclusie
In het onderzoek beschreven in dit proefschrift heb ik nieuwe toepassingen van het CCA organoïd model onderzocht en heb ik het model aangevuld met componenten uit de tumor micro-omgeving. Gal is een minimaal invasieve bron voor gezonde organoïden van de galwegen buiten de lever, die uitgebreid kan worden naar CCA patiënten in toekomstig onderzoek. Kinoom profilering van CCA organoïden is een veelbelovende techniek om therapeutische aanknopingspunten te identificeren en om, gecombineerd met het screenen van medicijnen, nieuwe biomarkers for therapie stratificatie te vinden. Ook kan het effect van inflammatoire cytokines bestudeerd worden in CCA organoïden. Dit heeft geresulteerd in de observatie dat het cytokine IL-17A een proliferatie-inducerende factor is en een mogelijk nieuw therapeutisch aanknopingspunt. Voor de uitbreiding van het tumor model, heb ik CCA organoïden succesvol gecombineerd met immuuncellen en gekweekt in gedecellulariseerde ECM om nieuwe modelsystemen te creëren die de patiënt tumor beter representeren en een platform vormen om immunotherapie en ECM-gerichte therapie te onderzoeken. Kortom, CCA organoïden zijn in hun huidige vorm, of uitgebreid met andere tumorcomponenten, een veelbelovend model voor de ontdekking van nieuwe therapieën en tumor stratificatie strategieën. Er is echter nog veel extra onderzoek nodig om deze organoïden technologie ook echt toe te passen in de kliniek en nuttig te maken voor de individuele patiënt.