Reinier Damman

Voor het overleven van cellen zijn zij erg afhankelijk van het waarnemen van- en reageren op hun omgeving. Dit doen zij vaak door middel van eiwitten, wat de moleculaire machines van de cel zijn. Om te kunnen begrijpen hoe deze eiwitten hun precieze functies kunnen uitvoeren, is het van belang om de structuur van het eiwit zo gedetailleerd mogelijk op te lossen. Echter, de de relatie tussen de structuur en functionaliteit van eiwitten is complex, maar desalniettemin van cruciaal belang voor een cellulaire balans. Wanneer een eiwit geactiveerd wordt door bijvoorbeeld ligand binding, leidt dit vaak tot conformationele veranderingen. Eerdere publicaties hebben gesuggereerd dat conformationele veranderingen mogelijk zijn omdat eiwitten intrinsieke dynamische domeinen hebben, waarna stablisiatie optreedt na ligand binding en daarmee het eiwit activeerd. Daarbij komt ook dat het fysiologische milieu van eiwitten vaak ook een grote invloed heeft op hun functionaliteit. Wanneer nieuwe eiwitten gesynthetiseerd worden, zullen deze in eukaryote cellen functionele additionele modificaties krijgen. Daarbij komt ook dat membraaneiwitten zich vaak in gespecialiseerde lipide-omgevingen bevinden waarbij de lipides een directe interactie hebben met het eiwit. Het is daarom van cruciaal belang om structurele studies uit te voeren onder fysiologisch relevante omstandigheden. Dit brengt echter een probleem met zich mee dat voor de meeste structerele biologische technieken gelimiteerd zijn door de specifieke eisen waarbij de monsters vaak vereenvoudigt worden en ze uit hun fysiologisch omgevingen worden gehaald. Vaste-stof Nucleaire Magnetische Resonantie (ssNMR) spectroscopie biedt echter unieke mogelijkheden voor structurele studies, omdat de complexiteit en formaat van een monster niet limiterend is. Daarnaast kan ssNMR simultaan informatie verschaffen over dynamische en rigide onderdelen van een eiwit. In dit proefschrift beschrijven we experimenten waarin we de dynamiek, activatie en functionaliteit bestuderen in complexe systemen middels ssNMR en moleculaire biologische proeven. Deze systemen spelen een centrale rol in de ontwikkeling van kanker, zoals borstkanker, maar ook in neurodegeneratieve ziektes.

In de afgelopen jaren wordt er meer energie geïnvesteerd in de ontwikkeling van nieuwe ssNMR methoden die het mogelijk maken om cellulaire of zelfs in-cel ssNMR monsters te maken. In hoofdstuk 2 presenteren wij een overzicht van recente literatuur over ontwikkelingen in monsterpreparatie voor zowel prokaryote als eukaryote preparaten. Deze methoden bieden de mogelijkheid om bijvoorbeeld specifiek een enkel eiwit te maken in een cel dat verrijkt is met NMR-actieve isotopen of beschrijft de mogelijkheid om een NMR-zichtbaar eiwit in een cellulair systeem te krijgen. Het literatuuroverzicht benadrukt de toename in interesse in dit veld en de relevantie van dit type onderzoek voor structurele studies.

De fysiologisch omgeving is van cruciaal belang voor de intrinsieke dynamica van het extracellulaire domein (ECD) van de Epidermale Groeifactor Receptor (EGFR), maar een rol voor deze dynamica hiervan was nooit aangetoond. Hoofdstuk 3 geeft nieuwe data weer waarin we, door middel van allosterische nanobodies, hebben kunnen aantonen dat de conformationele vrijheid van het ECD essentieel is voor het functioneren van EGFR. De allosterische nanobodies zetten een scharnier vast in het ECD waardoor EGFR niet meer functioneerd. Door het aanbrengen van puntmutaties in het nanobody konden we het dynamisch karakter van het ECD herstellen en zelfs versterken, wat leidde tot een toename van zowel de activiteit en internalisatiesnelheid van EGFR.

Doordat de dynamica van het ECD cruciaal is voor de activatie van EGFR, vroegen wij ons af of dit een algemeen eigenschap is van groeifactorreceptoren. In hoofdstuk 4 hebben we de methode die voorheen is gebruikt voor onze EGFR-studies toegepast op een nieuwe cellijn die een grote overexpressie heeft van HER2, een familielid van EGFR in de receptor tyrosine kinase-familie. De kristal structuur van HER2 ECD geeft een “open” conformatie weer, waardoor men denkt dat de ECD van HER2 rigide is en altijd klaar is om met andere receptoren een interactie aan te gaan. Daarnaast is HER2 een unieke receptor omdat er geen activerend ligand voor gevonden is, waardoor de activatie van de receptor afhangt van heterodimerisatie met andere receptoren. In dit hoofdstuk hebben we middels ssNMR-metingen aangetoond dat, in tegenstelling tot de algemene aanname, het ECD van HER2 ook dynamisch is voordat deze gestimuleerd is. Indirecte stimulatie van HER2 via EGFR door middel van EGF leidt tot een toename van het HER2 fosforylatieniveau en een toename in ECD-rigiditeit. Tot slot hebben we een nanobody gebruikt om de details van HER2 beter te begrijpen. In hoofdstuk 3 hebben we dit remmende nanobody gekarakteriseerd en aangetoond dat de ECD van EGFR licht gestabiliseerd wordt. Het anti-EGFR nanobody was in staat om via indirecte stimulatie HER2 fosforylatie en ECD stabilisatie te induceren. We concluderen dat een rigide dimerisatie-epitoop, en niet ligandbinding, de drijfveer is voor het dimeriseren en functioneren van HER2.

Hoofdstuk 5 beschrijft een ander systeem waarin het dynamisch karakter belangrijk is voor het functioneren van het eiwit. We maakten gebruik van zowel vloeistof als vaste-stof NMR om het proces van fasetransitie in detail te beschrijven. Onze data toont aan dat Edc3 in gist betrokken is bij het vormen van membraanloze compartimenten zonder grote structurele veranderingen. Echter, fasetransitie zorgt ervoor dat flexibele en ongestructereerde onderdelen van Edc3 tijdelijk betrokken zijn bij zwakke intermoleculaire interacties. De som van deze interacties leidt tot de formatie van een groter macromoleculair systeem die door het dynamische karakter nog steeds functioneel is.

Hoewel structureel onderzoek gedaan kan worden aan in situ monsters middels ssNMR, is er nog steeds een gat tussen cellen in het menselijk lichaam en cellen in het laboratorium. In de biologie wordt er daarom meer gebruik gemaakt van driedimensionele celkweeksystemen die potentieel een goede in vitro-representatie zijn van het lichaam. In hoofdstuk 6 hebben we een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt om op grote schaal homogene tumormodelsystemen te groeien en deze vervolgens te bestuderen middels ssNMR. Onze data bevestigen dat de 3D modelsystemen de experimentele condities van ssNMR overleven. Hierdoor is het mogelijk om bijvoorbeeld farmacologisch relevant onderzoek te doen, direct in een 3D tumor model systeem.

Samengevat presenteer ik in dit proefschrift onderzoek dat het dynamisch karakter van eiwitten cruciaal is: het verbindt de structuur en de functionaliteit van het eiwit. De fysiologische omgeving speelt hierbij een belangrijke rol en beïnvloed mogelijk direct de structuur en functionaliteit van eiwitten