Paweena Diloksumpan

De moderne drie-dimensionale (3D) bioprinttechnieken bieden verschillende mogelijkheden voor de productie van op maat gemaakte chondrale of osteochondrale implantaten, maar het met behulp van deze technieken integreren van materialen met (zeer) uiteenlopende mechanische eigenschappen is nog steeds een forse uitdaging binnen de regeneratieve geneeskunde. In dit proefschrift wordt via een tweetal wegen geprobeerd een antwoord op deze uitdaging te vinden. Deze twee benaderingen zijn: 1) de ontwikkeling van printbare materialen voor de productie van de botcomponent van het implantaat met dusdanige fysische en chemische eigenschappen dat die materialen tegelijkertijd geprint kunnen worden met de hydrogelen die gebruikt worden voor het kraakbeengedeelte van het implantaat; en 2) de ontwikkeling van een proces waarbij op meerdere schaalniveaus geprint kan worden om de bot- en kraakbeencompartimenten te kunnen integreren. Via deze routes wordt in dit proefschrift een veelbelovende strategie ontwikkeld waarbij verschillende 3D (bio-)printtechnieken gecombineerd worden om een geïntegreerd osteochondraal implantaat te produceren dat bestaat uit een kraakbeendeel dat gebaseerd is op hydrogelen die met microvezels versterkt zijn en een botcompartiment op basis van een calciumfosfaat product.

Recent is aangetoond dat de drukbestendigheid van gelatine methacrylaat (gelMA) hydrogelen verbeterd kan worden, tot waarden die vergelijkbaar zijn met die van natuurlijk kraakbeen, door gegoten gelen te verstevigen met fijne polycaprolactone (PCL) netwerken die geproduceerd zijn door middel van melt electrowriting (MEW), een 3D printtechniek op microschaal waarbij vezelstructuren gemaakt worden uit polymeersmeltingen. Deze versterkte, kraakbeenvervangende structuren moeten dan nog stevig verankerd worden in de onderliggende botcomponent om zo samen een optimaal functioneel osteochondraal implantaat te vormen.

In dit proefschrift wordt een methode beschreven om dit te realiseren (Hoofdstuk 3). Er wordt aangetoond dat ingewikkelde structuren die geproduceerd zijn met MEW en opgebouwd zijn uit vezels van PCL, een materiaal dat al bij een relatief lage (60°) temperatuur smelt, hun karakteristieke architectuur (samen met de hydrogelen bepalend voor de mechanische eigenschappen) behouden wanneer ze gecombineerd worden met een keramische botcomponent die uithardt bij lage temperatuur. Voor die botcomponent werd, uitgaande van alfa-tricalciumfosfaat (α-TCP), een materiaal ontwikkeld dat uithardt bij fysiologische temperaturen. Dat materiaal werd gecombineerd met een specifiek ontwikkelde thermoreversibele drager voor hydrogelen. Een dergelijke samengestelde keramische component kan dan uitharden op lage temperatuur waarbij calciumdeficiënt hydroxyapatiet (CDHA) gevormd wordt waardoor het mogelijk wordt labiele materialen zoals PCL hierin integraal op te nemen. Het mengsel van α-TCP met de thermoreversibele hydrogel geeft het materiaal shear-thinning eigenschappen die het mogelijk maken het materiaal te gebruiken als bio-inkt voor extrusie-printen bij omgevingstemperatuur. Dat maakt het produceren van een verbindende structuur tussen de kraakbeen- en botfase van het implantaat, vergelijkbaar met de subchondrale botplaat in de natuurlijke situatie, mogelijk. De geïntegreerde PCL-CDHA structuren werden verkregen na het uitharden van de direct op het PCL microvezel versterkingsnetwerk geprinte calciumfosfaat composiet (pCaP). Op deze manier werd de resistentie tegen afschuifkrachten van de verbinding tussen kraakbeen- en botcomponent van het implantaat aanzienlijk verhoogd. Dat maakte het mogelijk de chondrale regio met hydrogel te combineren met de botcomponent en maakte het implantaat tevens bestand tegen de manipulatie bij de implantatie in het defect, zowel in de ex vivo als in de in vivo situatie.

Voorafgaand aan de translatie naar in vivo van deze samengestelde biomaterialen zijn de mechanische en biologische eigenschappen ervan uitgebreid onderzocht met als specifiek aandachtspunt het botvormende vermogen van het botanker. Dat is uiteraard van groot belang voor implantaten die bedoeld zijn voor het genezen van osteochondrale defecten.

Het bleek dat bij een porositeit tussen de 20 en 60% de geprinte CDHA structuur vergelijkbare belastbaarheid op druk had als menselijk subchondraal bot. Ook bleek dat uit het beenmerg afkomstige mesenchymale stromale cellen niet alleen konden groeien in medium met CDHA en op het geprinte CDHA zelf, maar zich ook konden ontwikkelen als botvormende cellen indien ze voorzien werden van specifieke factoren die de botvorming stimuleren. Deze positieve bevindingen vormden de basis voor een in vivo studie naar het effect van twee vormen van porositeit op het botvormend vermogen van cylindervormige CDHA structuren; een constante porositeit werd hierbij vergeleken met een van boven naar beneden toenemende porositeit (zoals ook het geval is in natuurlijk subchondraal bot) (Hoofdstuk 4). Deze studie werd gedaan bij paarden waarbij een groot defect gecreëerd werd in bot op een niet op druk belaste locatie en waarbij botingroei slechts van onderop kon plaatsvinden. Uit de studie bleek dat de verhouding tussen resorptie van de CDHA-structuur en botnieuwvorming beter was bij de structuur met de constante porositeit en ook was bij die structuren de botnieuwvorming meer homogeen verdeeld. Op basis van deze bevindingen werd de keuze gemaakt voor deze CDHA architectuur voor de verdere ontwikkeling van het osteochondrale implantaat.

Het uiteindelijke implantaat werd getest in een tweetal in vivo studies in het kniegewricht van ponies. Bij deze studies zat het verschil in het kraakbeendeel van het osteochondrale implantaat; het botdeel en de overgang van bot naar kraakbeen bestonden in beide gevallen uit de bovenbeschreven calciumfosfaat composiet waarin de MEW microvezels waren verankerd.

In de eerste studie werd in het kraakbeendeel gelMA, met daarin kraakbeenstamcellen (ACPCs) en met toevoeging van de groeifactor GDF-2 (growth differentiation factor 2), gegoten in het netwerk van PCL vezels wat resulteerde in de vorming van een kraakbeenachtige schijf die omgeven werd door de PCL vezels na een voorkweek van een maand (Hoofdstuk 5). In de tweede studie werd de gel met daarin de kraakbeenstamcellen samen geprint met het PCL netwerk en werd het geheel eveneens gedurende een maand gekweekt in een chondrogeen medium (Hoofdstuk 6). Voor beide studies werden celvrije implantaten als controles gebruikt. In beide gevallen deden de ACPCs het goed in de voorkweek en werd er een kraakbeenachtige extracellulaire matrix gevormd met glycosaminoglycanen (GAGs) en collageen type II. Na 6 maanden in vivo waren de resultaten echter sterk verschillend, hetgeen herleid kon worden tot het (dis)functioneren van het botdeel van het implantaat.

Bij de GDF-2 studie was er sprake van een sterke afname van het GAG-gehalte en van de biomechanische eigenschappen. In het botgedeelte was er maar een minimale hoeveelheid bot gevormd en ook waren er aanwijzingen voor een redelijk ernstige ontsteking, zowel in de groep met als in die zonder cellen. Verder was het duidelijk dat vele implantaten niet (meer) juist in de osteochondrale defecten zaten, maar verzakt waren of anderszins van positie veranderd. Geconcludeerd moest worden dat de combinatie van een suboptimale pasvorm van het botdeel van de implantaten met een grote brosheid van de keramische component geleid had tot het ontstaan van schade bij de chirurgische procedure die uiteindelijk geresulteerd heeft in fragmentvorming en verlies van voldoende stevigheid om de belasting te kunnen verdragen met als gevolg het inzakken van het hele implantaat.

Bij de andere studie waren de resultaten veel beter. De iets andere fabricagetechniek had bij dat experiment tot een veel beter passen van het implantaat gezorgd, waardoor de bovengenoemde problemen niet speelden en het implantaat bijna geheel gevrijwaard bleef van structurele schade. Bij dit experiment bleek het GAG-gehalte over de implantatieperiode niet afgenomen, maar juist (licht) gestegen. Dat gold ook voor de mechanische eigenschappen. In de botcomponent van het implantaat was er goede botnieuwvorming. Een bijzondere bevinding was dat deze gunstige resultaten voor zowel de implantaten met als zonder cellen golden.

Al met al laten beide studies de beperkingen van de gebruikte calciumfosfaat composiet zien, maar ook de veelbelovendheid van het type osteochondraal implantaat zoals dat ontwikkeld is in dit proefschrift. Ook is duidelijk geworden dat het paardenmodel weliswaar uitdagend is, maar tegelijkertijd ook zeer relevant, zowel als translationeel model als voor klinische toepassingen bij de diersoort zelf, waar sprake is van een duidelijke klinische vraag.

Samenvattend kan gesteld worden, dat dit proefschrift laat zien hoe er door het uitgekiende gebruik van verschillende 3D printtechnieken om componenenten met heel verschillende mechanische eigenschappen integraal te verbinden, belangrijke voortgang is geboekt bij de ontwikkeling van regeneratieve osteochondrale implantaten die voldoende mechanische kwaliteiten hebben. Natuurlijk moeten er nog wel enige stappen gezet worden voordat er sprake is van een product dat toepasbaar is in de kliniek, met name op het gebied van vermindering van de brosheid van het botgedeelte. Verder zal er ook nog gekeken moeten worden naar de verbinding van de kraakbeen- en botdelen, met name op het vlak van de permeabiliteit en de optimale opvang en verdeling van de belasting. De natuurlijke situatie kan daarbij als voorbeeld dienen.

Three-dimensional (3D) printing technologies offer multiple possibilities for the custom-tailored fabrication of either cartilage or bone grafts. However, employing this technology for the integration of different materials that possess mechanically distinct properties, is still a major challenge in tissue engineering and regenerative medicine. To address this challenge, two main approaches were developed in this thesis: 1) the development of printable materials for use as a bone scaffold with physical and chemical properties that permit their patterning in direct contact with the microfiber-reinforced hydrogels that are used as chondral substitutes, and 2) the development of a multi-scale printing process for integrating such bone and cartilage compartments. Therefore, this thesis presents a promising strategy for combining different 3D printing technologies to integrate microfiber-reinforced, hydrogel-based chondral constructs and calcium phosphate-based subchondral bone compartments, in order to establish and engineer a functional osteochondral interface.

Recently, the compressive properties of gelatin methacrylate hydrogels (gelMA) were increased to values comparable to those of native cartilage, by reinforcing cast gels with polycaprolactone (PCL) microfiber meshes that were produced by melt electrowriting (MEW), a microscale 3D printing technology. To further improve such composite structures and enable their application in large osteochondral defects, the anchoring of such reinforced structures on osteal scaffolds in a way that mimics the natural subchondral bone, was addressed in this thesis (Chapter 3). Highly organized microfiber lattices produced by MEW using PCL, a thermoplastic synthetic polymer susceptible to melt at relatively low temperatures (approximately 60°C), were shown to preserve their unique architecture (responsible for the mechanical reinforcement that is observed in combination with infused hydrogels), when combined with low-temperature setting ceramics.

For this purpose, a calcium phosphate-based material that could set at physiological temperature, with alpha-tricalcium phosphate (α-TCP) as main ceramic component, was developed and combined with a custom-synthesized thermo-reversible hydrogel carrier. Such composite bioceramics can be solidified at low temperature, forming calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA). This process is compatible with the inclusion of labile materials like PCL. The mixture of α-TCP with the thermo-reversible hydrogel endowed the system with shear-thinning properties that allowed the use of the composite as bio-ink for printing with an extrusion-based printer at ambient temperature, hence facilitating the fabrication of a subchondral bone plate-mimicking interface and a cancellous bone-mimicking structure underneath. These integrated PCL-CDHA structures were obtained after solidification of directly dispensed printable calcium phosphate-based composite (pCaP) onto the PCL microfiber reinforcing framework of the chondral compartment. The adequate and secure integration permitted to greatly increase the shear strength of the engineered bone-to-cartilage boundary, which permitted additional manipulation of the construct, such as hydrogel infusion in the chondral region and implantation in surgically produced osteochondral defects ex vivo and in vivo.

Prior to the in vivo translation of these composite biomaterials, this thesis extensively investigated the mechanical and biological performance in vitro of the constructs, thereby focusing on unravelling the bone-forming potential of the osteal anchor, a necessary step for functional healing of osteochondral defects. The porous CDHA structures produced by 3D printing appeared to exhibit compressive properties within the range of human cancellous bone when porosity ranged between 20% and 60%. Additionally, bone-marrow derived mesenchymal stromal cells were shown to proliferate both within CDHA-incubated medium and on the printed CDHA itself, and to differentiate toward the osteogenic lineage when supplemented with osteogenic induction factors. These positive findings justified proceeding with in vivo evaluations. For that purpose, cylindrical, 3D printed bony scaffolds displaying different pore distributions, with either a constant porosity throughout the scaffold or a decreasing gradient of porosity along the axial direction of the cylinder (as in natural subchondral bone), were tested in a large (cm-scale) critical size bone defect in a non-load-bearing orthotopic location in an equine model (Chapter 4). A PCL case around the cylinder permitted invasion of the newly-formed bone only from the bottom. Results demonstrated better scaffold resorption, paired with more and more homogeneous bone regeneration in the implants with constant porosity. Given this superior performance, the constant porosity architecture was chosen for the further development of the osteochondral construct for cartilage repair at a load-bearing site.

The final concepts of the osteochondral graft were tested in two in vivo studies in ponies in which the chondral compartments had a different composition and architecture. In both implants the bone phase and interphase between the bone and the cartilage phase were similar consisting of the pCaP composite with anchored MEW fibers as osteal anchor and subchondral bone phase of the graft. In the first study, the chondral phase was composed by articular cartilage derived progenitor cells (ACPCs) seeded within the PCL mesh, and stimulated during pre-culture in vitro with growth differentiation factor-2 (GDF-2), resulting in the formation of a cartilaginous disc entangled within the polymeric microfibers (Chapter 5). In the second study, ACPC-laden gelMA was co-printed with the PCL meshwork and the constructs were cultured for a month with chondrogenic differentiation media (Chapter 6). Cell-free controls were used in both studies. In all cases, regardless of the configuration of the implant, the scaffolds permitted ACPCs to proliferate and produce cartilage-related extracellular matrix molecules, such as glycosaminoglycans (GAGs) and type II collagen during the 4-week culture prior to implantation. After an implantation for 6 months, the results were totally different for the two studies, which seemed to be due to striking differences in the performance of the bony phases.

In the GDF-2 study, at 6 months after implantation the GAG-content of the cell-laden structure had substantially decreased compared to the level after pre-culture. There was also a minimal volume of newly-formed bone, and a rather heavy inflammatory reaction was observed after implantation for 6 months, both in the cell-laden group and in the cell-free control. Additionally, misalignment and misposition of the grafts was clearly visible.

In the other group, pre-culture GAG content had slightly increased from the time of implantation until 6 months after implantation in the study. Interestingly, a similar GAG content was observed in cell-free controls. The volume of newly-formed bone in the subchondral bone compartment was higher compared with the GDF-2 study and there was much less misalignment.

It was hypothesized that the imperfect geometry of the printed subchondral bone compartment in the GDF-2 study, combined with the brittleness of the ceramic material might have led to structural damage of the implants during surgical implantation, fragilizing the structure and eventually leading to its collapse when subjected to loading, and overall implant failure. This had not happened in the other study thanks to the use of a mold in that study when producing the bone phase, which led to better shape fidelity post-printing and thus better geometrical fitting in the defects. These studies, while showing the appropriateness of the concept and the feasibility of the proposed approach, also clearly demonstrated the limitations of the current, brittle, pCaP composite for application at load-bearing sites. Finally, the equine model showed to be a challenging, but relevant model as a translational model preparing for clinical use in human and animal patient populations.

It can be concluded that the work in this thesis has produced substantial progress towards the final goal of clinical translation of fully mechanically competent and regenerative osteochondral grafts by the clever use of various 3D-printing technologies to integrate two mechanically distinct materials together to form an entire osteochondral graft. Nevertheless, there are several challenges that still need to be explored further, especially regarding the development of alternative materials with higher fracture toughness for the bone compartment. Additionally, improvements can be made to the interface itself as well. For instance, with respect to permeability and its role in load distribution and dissipation. Better recapitulation of the natural situation may be the way to go here.

List of Abbreviations

2D two-dimensional
3D three-dimensional
ACPCs articular cartilage-derived progenitor cells
ALP alkaline phosphate
AM additive manufacturing
APS ammonium persulphate
ASAP L-ascorbic acid 2-phosphate
α-MEM minimum essential medium alpha
α-TCP alpha-tricalcium phosphate
bFGF basic fibroblast growth factor
BID twice a day
BMP-7 bone morphogenetic factor-7
β-GP beta-glycerophosphate
C crosslinkable
CAD computer aided design
CaP calcium phosphate
CBC complete blood count
CDHA calcium deficient hydroxyapatite
C-pCaP crosslinkable printable calcium phosphate
CR ceramic remnant
DAB 3, 3-diaminobenzidine-horseradish peroxidase
DLP digital light projection
DMA dynamic mechanical analyzer
DMMB dimethylmethylene blue
ECM extracellular matrix
FCS fetal calf serum
FDM fused deposition modelling
GAGs glycosaminoglycans
GDF-2 growth differentiation factor-2
gelMA methacryloyl-modified gelatin
GRF ground reaction force
HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
H&E hematoxylin and eosin
IGF-1 insulin-like growth factor-1
IM intramuscular
IV intravenous
LDH lactate dehydrogenase
LVR linear viscoelastic range
MEW melt electrowriting
MMA methyl methacrylate
MRI magnetic resonance imaging
MSCs mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells
µ-CT micro-computed tomography
NaOH sodium hydroxide
Nano-HA nano-hydroxyapatite
NB new bone ingrowth
NC non-crosslinkable
NC-pCaP non-crosslinkable printable calcium phosphate
OC osteochondral
PCL polycaprolactone
PDMS polydimethylsiloxane
PLA polylactic acid
PO oral administration
ROI region of interest
ROM range of motion
SD standard deviation
SEM scanning electron microscopy
SID once a day
TEMED tetramethylethylenediamine
TGF-β3 transforming growth b3
TRAP tartrate-resistant acid phosphatase
VOI volume of interest
XRD x-ray diffraction pattern