Nil Schubert

Neuroblastomen zijn tumoren die ontstaan in het sympathische zenuwstelsel. Het zijn de meest voorkomende solide tumoren in kinderen jonger dan een jaar. De jaarlijkse incidentie bedraagt 10,5 per één miljoen en kinderen zijn gemiddeld 17-22 maanden oud ten tijde van de diagnose. De diversiteit binnen de neuroblastomen is groot en reikt van tumoren die spontaan verdwijnen tot hoog-risico tumoren die om een intensief behandelprotocol vragen. De risicogroep wordt bepaald aan de hand van verschillende risicofactoren, zoals leeftijd, MYCN-amplificatie en andere chromosomale afwijkingen. Hoewel we hoog-risico tumoren in eerste instantie goed kunnen behandelen, komt de tumor bij ongeveer de helft van deze patiënten terug. De overlevingskansen nemen dan af tot minder dan 10%.

In neuroblastomen zien we over het algemeen weinig terugkerende mutaties. Toch is de regulatie van de celcyclus en celdood in vrijwel alle hoog-risico neuroblastomen en recidieven verstoord. Voor deze deregulatie kunnen verschillende genetische factoren verantwoordelijk zijn. De studies die in dit proefschrift zijn gebundeld, behandelen verschillende afwijkingen en aspecten van de p53 en/of de pRb “pathways” (signaaltransductiepaden). De p53 pathway reguleert apoptose (geprogrammeerde celdood) en is in neuroblastomen vaak verstoord door hoge expressie van MDM2 of verlies van p14ARF (één van de genen waarvoor het CDKN2A locus codeert). Mutaties in p53 komen in veel soorten tumoren voor, maar bij neuroblastomen zijn deze relatief zeldzaam. De pRb pathway is verantwoordelijk voor de transitie van de G1 naar de S fase gedurende de celcyclus. Deze pathway is regelmatig overactief door verhoogde levels van cycline D1 of CDK4, of door verlies van p16INK4a (het andere gen van het CDKN2A locus).

Om de therapie beter af te stemmen op de patiënt en de specifieke mutaties van diens tumor, wordt steeds vaker gebruik gemaakt van gepersonaliseerde geneeskunde (“personalised medicine”). Hierbij worden de (genetische) afwijkingen van de tumor bepaald en vervolgens medicijnen toegediend die gericht aangrijpen op deze specifieke afwijkingen in de tumor. Doordat er relatief weinig kinderen met kanker zijn, richt onderzoek voor nieuwe medicijnen zich vooral op volwassenen. Om inzicht te krijgen in de mogelijkheid en het nut van het remmen van een bepaald eiwit of pathway, beschrijven we in hoofdstuk 2 een nieuwe methode voor een systematische “review” (evaluatie van bestaande studies). Middels deze review kan bovendien (pre)klinisch onderzoek naar doelgerichte medicijnen (“targeted drugs”) beter worden geprioriteerd. Onze zogenaamde Target Actionability Review (TAR) methode gebruikt negen proof-of-concept (PoC) modules om naar verschillende aspecten van een eiwit/pathway of medicijn te kijken. Bij deze methode worden simpele zoektermen gebruikt om PubMed (zoekmachine voor wetenschappelijke papers) te doorzoeken en lezen twee beoordelaars, onafhankelijk van elkaar, de gevonden relevante papers kritisch door. Belangrijke elementen worden samengevat en zowel de kwaliteit van de beschreven experimenten als de uitkomst ervan worden voor elk artikel en elke PoC module beoordeeld. Deze beoordeling vindt plaats aan de hand van scores en gedefinieerde criteria. De gegeven scores worden vergeleken en discrepanties worden beoordeeld door een derde beoordelaar. De drie beoordelaars proberen vervolgens overeenstemming te bereiken. Uiteindelijk worden de gemiddelde scores weergegeven in een heatmap, die voor iedereen toegankelijk is via het R2 data portal [r2.amc.nl].

In dit hoofdstuk hebben we de TAR-strategie toegepast op MDM2-TP53 in 10 kindertumoren, zowel solide tumoren als hersentumoren. Dit resulteerde in een uitgebreide beoordeling van 101 publicaties, die goed waren voor 343 items voor de heatmap. PoC module 1 (‘Target/pathway activation in paediatric clinical series’) was de module die het vaakst was beschreven, evenals de tumorentiteiten neuroblastoom, osteosarcoom en rhabdomyosarcoom. Voor verschillende indicaties (zoals maligne perifere zenuwschedetumoren, rhabdoïde tumoren, hepatoblastomen en inflammatoire myofibroblastische tumoren) ontbreekt nog veel preklinische data. Ook voor de modules ‘Tumor target dependence in vitro/in vivo’, ‘Predictive biomarkers’ en ‘Resistance mechanisms’ is weinig data beschikbaar. Er waren bovendien geen klinische studies die geïncludeerd konden worden. Desalniettemin laat onze review zien dat klinische evaluatie van MDM2 remmers in neuroblastomen, rhabdomyosarcomen en hooggradige gliomen veelbelovend kan zijn. De beste resultaten zullen waarschijnlijk worden behaald wanneer MDM2 remming wordt gecombineerd met chemotherapie.

In hoofdstuk 3 hebben we dezelfde TAR-strategie ook toegepast op CDK4/6. In de uiteindelijke heatmap konden we 54 publicaties en 116 items includeren. De indicaties die het meeste waren beschreven waren neuroblastoom, osteosarcoom, rhabdomyosarcoom en medulloblastoom. PoC 1a (‘CDK4/6 gain/amplification/overexpression’) was de meest beschreven module. Gebaseerd op de geïncludeerde studies lijkt CDK4/6 overexpressie het vaakst voor te komen in rhabdomyosarcomen en Wilms tumoren, terwijl CDK4/6 remmers in Ewing sarcoom-cellijnen en muismodellen van medulloblastoom het meest effectief waren. Onze studie liet zien dat preklinische data for veel indicaties nog ontbreekt, o.a. voor retinoblastoom, laaggradige gliomen en ependymomen. Ook studies over ‘Tumour target dependence in vivo’ (PoC 3), ‘Predictive biomarkers’ (PoC 4) en ‘Resistance mechanisms’ (PoC 6) waren schaars. Uit de resultaten van de TAR blijkt dat er nog veel preklinisch werk gedaan moet worden om goed te kunnen bepalen of de remming van CDK4/6 daadwerkelijk nuttig en effectief is in kinderkanker. Op basis van de geïncludeerde studies, lijken CDK4/6 remmers het meest veelbelovend bij Ewing sarcoom en medulloblastoom (met name bij Groep 3 en SHH-tumoren), hoewel mogelijk ook patiënten met neuroblastoom, rhabdomyosarcoom of een hooggradig glioom baat kunnen hebben bij deze behandeling. Voor de beste resultaten zal ook hier waarschijnlijk een combinatie met chemotherapie nodig zijn.

In hoofdstuk 4 hebben we de effectiviteit van remming van MDM2 en CDK4/6 in neuroblastomen verder onderzocht. We hebben hiervoor tien cellijnen met verschillende genetische achtergronden gebruikt en vonden dat zowel MDM2-amplificatie als een homozygote deletie van CDKN2A de cellen niet gevoeliger maakte voor MDM2 remmers. Ook de gevoeligheid voor CDK4/6 remmers was niet verhoogd in cellen met CDK4-amplificatie of CDKN2A-deletie. Het gebrek aan biomarkerpotentiaal van MDM2 en CDK4 konden we bevestigen in cellijnen met induceerbare overexpressie van MDM2 en/of CDK4. Bij overexpressie van deze eiwitten nam de gevoeligheid voor MDM2 en CDK4/6 remmers namelijk niet toe. Aangezien MDM2 en CDK4 vaak tegelijkertijd geamplificeerd zijn, hebben we de lijnen uit ons panel met idasanutlin (MDM2 remmer) en abemaciclib (CDK4/6 remmer) behandeld. Deze gelijktijdige behandeling bereikte echter in geen van de cellijnen een synergistisch resultaat. We toonden aan dat abemaciclib juist het pro-apoptotische effect van idasanutlin verminderde. Dit gebrek aan synergie konden we ook aantonen in muismodellen, waarin de gelijktijdige behandeling niet beter werkte dan de som van de losse behandelingen. We adviseren daarom om voorzichtig te zijn met het combineren van MDM2 en CDK4/6 remmers in neuroblastoompatiëntjes. We hebben bovendien laten zien dat het remmen van een oncogen (een gen dat betrokken is bij het ontstaan van kanker) dat verhoogd tot expressie komt, niet altijd voldoende is om de groei te remmen. Deze resultaten geven aan dat we betere biomarkers nodig hebben voor MDM2 en CDK4/6 remmers, maar ook dat we op zoek moeten gaan naar betere behandelopties voor neuroblastomen met MDM2/CDK4-amplificatie.

Omdat we in het vorige hoofdstuk zagen dat cellen met een homozygote deletie van CDKN2A niet gevoeliger waren voor MDM2 en/of CDK4/6 remmers, hebben we dit locus, dat codeert voor twee belangrijke tumorsuppressorgenen (genen die tumorgroei remmen, maar bij mutatie/inactivatie juist bevorderen), verder onderzocht. In hoofdstuk 5 hebben we het CRISPR-Cas9 systeem gebruikt om beide genen (p14 en p16) zowel los van elkaar als gelijktijdig in SY5Y neuroblastoomcellen te inactiveren. Op deze manier konden we de gevolgen van de verschillende genetische situaties onderzoeken en met elkaar vergelijken. We hebben vervolgens de RNA expressiepatronen van deze verschillende cellen in kaart gebracht. Hierbij zagen we de meeste verandering ten opzichte van de wildtype (niet gemodificeerde) cellen in de p16 en de p14+p16-geïnactiveerde cellen, terwijl p14-geïnactiveerde cellen meer op de SY5Y wildtype cellen leken. Bij inactivatie van p16 of p14+p16 kregen cellen een meer mesenchymaal karakter en leken ze meer op cellen die een rol spelen in de vroege ontwikkeling van neuroblastomen (voorlopers van Schwanncellen). We hebben vervolgens bijna 200 verschillende medicijnen getest op deze cellijnen. Opnieuw waren er meer veranderingen ten opzichte van wildtype cellen te zien bij de p16 en de p14+p16-geïnactiveerde cellen dan bij de p14-geïnactiveerde cellen. Het grootste verschil in gevoeligheid was te zien voor EGFR remmers: de cellen zonder p16 bleken veel gevoeliger voor deze remmers. Eiwitanalyses lieten vervolgens zien dat de EGFR pathway inderdaad actiever is in p14+p16-geïnactiveerde cellen. Apoptose trad in deze cellen al met een lagere concentratie afatinib, een EGFR remmer, op dan bij wildtype cellen. Bovendien remde afatinib de tumorgroei in muizen met een inactivatie van p14+p16. De resultaten van deze studie geven eerste inzichten in de gevolgen van een homozygote deletie van CDKN2A in neuroblastoomtumoren en het therapeutisch ingrijpen hierop.