Mandy Meekels Steinbusch

De cellulaire processen waaraan snoRNA's deelnemen zijn fundamentele processen die nodig zijn voor een goede celfunctie, maar hun rol bij celdifferentiatie, homeostase en ziekte in het algemeen is tot nu toe slecht onderzocht. Bovendien zijn snoRNA's in de context van chondrogene differentiatie, kraakbeenhomeostase en ziekte nog niet onderzocht. In het onderzoek beschreven in dit proefschrift hebben we daarom de betrokkenheid van snoRNA's bij verschillende aspecten van chondrocyten en kraakbeen onderzocht.

Hoofdstuk 2: Expressie van RMRP RNA wordt gereguleerd tijdens chondrocyt-hypertrofie en bepaalt de chondrogene differentiatie.
Mutaties in het RMRP-gen, dat codeert voor de snoRNA-component van het RNase MRP-complex, zijn de oorzaak van kraakbeen-haar-hypoplasie (CHH). CHH is geassocieerd met ernstige dwerggroei veroorzaakt door een verstoorde skeletontwikkeling. Het is echter niet duidelijk waarom mutaties in RMRP snoRNA leiden tot skeletdysplasie. Aangezien chondrogene differentiatie van de groeischijf vereist is voor de ontwikkeling van de lange pijpbeenderen, stelden we de hypothese op dat het RMRP snoRNA een cruciale rol speelt bij chondrogene differentiatie. Expressie van Rmrp RNA en RNase MRP eiwit-subunits werd gedetecteerd in de muizen-groeischijf en tijdens de chondrogene differentiatie van ATDC5-cellen, waarbij Rmrp RNA-expressie gecorreleerd bleek met chondrocyt-hypertrofie. Genetische interventie met Rmrp RNA-expressie in ATDC5-culturen veroorzaakte een deregulering van de chondrogene differentiatie, met een prominente impact op hypertrofie en veranderingen in pre-rRNA-verwerking en rRNA-niveaus (verlaagde niveaus van 18S en 5.8S rRNA). Promoter-reporterstudies toonden aan dat Rmrp RNA-expressie reageert op chondrogene morfogenen zoals PTHrP en bFGF (verminderde promoteractiviteit) en TGFβ3, BMP-2, WNT-3A en WNT-5A (verhoogde promoteractiviteit). Chondrogene transdifferentiatie van CHH-fibroblasten was verstoord met een uitgesproken impact op hypertrofische differentiatie, verhoogde niveaus van PTHrP en ophoping van het ITS-1 pre-rRNA-verwerkingsintermediair. Samen laten onze gegevens zien dat RMRP RNA-expressie gereguleerd wordt tijdens verschillende stadia van chondrogene differentiatie en wijzen ze erop dat RMRP RNA een cruciale rol kan spelen bij chondrocyt-hypertrofie, met mogelijke gevolgen voor de pathobiologie van CHH.

Hoofdstuk 3: Het antivirale eiwit viperine reguleert chondrogene differentiatie via CXCL10-eiwitsecretie.
RNase MRP heeft een aantal substraat-RNA's en van de meeste is het niet duidelijk hoe deze de celbiologische processen beïnvloeden, noch is bekend hoe deze betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van CHH of chondrogene differentiatie. Een van deze substraat-RNA's is het mRNA van viperine. Viperine is een eiwit dat zich in het endoplasmatisch reticulum bevindt en staat bekend om zijn rol als antiviraal eiwit. Expressie van viperine bleek verhoogd in CHH-leukocyten en na knockdown van RNase MRP-subunits. We ontdekten dat viperine tot expressie komt in differentierende chondrocytische cellen en hun eiwitsecretie en de uitkomst van chondrogene differentiatie reguleert door de TGF-β/SMAD2/3-activiteit te beïnvloeden via CXCL10, waarbij CXCL10 chondrogene differentiatie remt. Bovendien namen we verstoringen waar in deze viperine-CXCL10-TGF-β/SMAD2/3-as in chondrocytische CHH-cellen. Onze resultaten geven aan dat het antivirale eiwit viperine de chondrogene differentiatie controleert door de secretie van oplosbare eiwitten te beïnvloeden en we identificeerden een moleculaire route die de verstoorde chondrogene differentiatie van cellen van individuen met CHH kan verklaren.

Hoofdstuk 4: Aanpassing van het eiwit-translatiemechanisme tijdens ATDC5 chondrogene differentiatie.
Het RMRP snoRNA is een zeer specifiek snoRNA dat behoort tot een kleine groep van niet-canonieke snoRNA's. De meeraderheid van de snoRNA's in de cel behoort echter tot een groep canonieke snoRNA's die betrokken zijn bij de post-transcriptionele modificatie van rRNA's. Er wordt aangenomen dat het fijnafstemmen van de rRNA-pool van de cel door snoRNA-gemedieerde post-transcriptionele modificaties de modus van ribosoomactiviteit bepaalt en de getrouwheid van ribosoomtranslatie controleert. Er wordt verwacht dat dit bijzonder belangrijk is in translationeel actieve cellen, zoals chondrocyten in de groeischijf, om hun eiwitten nauwkeurig en efficiënt te synthetiseren voor de opbouw van de kraakbeenachtige extracellulaire matrix van de groeischijf en om hun hoge proliferatiesnelheid te ondersteunen. Daarom brachten we het volledige spectrum van snoRNA's in kaart die tot expressie komen tijdens verschillende fasen van chondrogene differentiatie. snoRNA's bleken differentieel tot expressie te komen tijdens de chondrogene differentiatie van ATDC5. Bovendien pasten de expressie van post-transcriptionele rRNA-modificatoren, zoals fibrillarine en dyskerine, evenals UBF-1 (betrokken bij rDNA-transcriptie) en het 18S, 5.8S en 28S rRNA-gehalte per cel zich aan de differentiatiestatus van ATDC5-cellen aan. Er werd een algemene impact op de translatiicapaciteit van de cel aangetoond, afhankelijk van de differentiatiestatus van de ATDC5-cellen. Onze gegevens toonden dus aan dat chondrogene differentiatie gepaard gaat met een aanzienlijke regulatie van mechanismen die betrokken zijn bij ribosoombiogenese en translatieactiviteit. Fase-specifieke expressie van snoRNA's suggereert dat specifieke snoRNA's het ontwikkelende fenotype van de chondrocyt kunnen moduleren via een op rRNA PTM gebaseerd mechanisme van ribosoomheterogeniteit, waardoor mogelijk de waargenomen dynamiek in translatieactiviteit die de loop van chondrogene differentiatie beïnvloedt, wordt vergemakkelijkt. Toekomstig werk zal naar verwachting de omvang van ribosoomheterogeniteit en regulatie in cellulaire differentiatie en de mogelijke implicaties voor menselijke ziekten onthullen.

Hoofdstuk 5: Serum-snoRNA's als biomarkers voor gewrichtsveroudering en posttraumatische artrose.
Bij artrose, net als bij chondrogene differentiatie, verandert het chondrogene fenotype actief. De ontwikkeling van effectieve behandelingen voor de leeftijdsgerelateerde ziekte artrose en het vermogen om ziekteprogressie te voorspellen, wordt belemmerd door het gebrek aan biomarkers die het verloop van de ziekte kunnen aantonen. Het profileren van de expressiepatronen van snoRNA's bij gewrichtsveroudering en artrose kan inzicht verschaffen in hun bijdrage aan gewrichtspathologie, hun gebruik als diagnostische biomarkers en hun potentieel als therapeutische doelen. Middels SnoRNASeq werd differentiële expressie van 6 snoRNA's geïdentificeerd in jonge versus oude gewrichten en 5 snoRNA's in oude 'sham' versus oude experimentele artrotische gewrichten. In serum vonden we de differentiële aanwezigheid van 27 snoRNA's in jong versus oud serum en 18 snoRNA's in oud 'sham' versus oud experimenteel artrotisch serum. Het profileren van de expressiepatronen van snoRNA's is de eerste stap bij het bepalen van hun functionele betekenis bij veroudering en artrose, en biedt potentiële diagnostische biomarkers en therapeutische doelen. Onze resultaten hebben snoRNA's aangemerkt als nieuwe markers voor musculoskeletale veroudering en artrose en impliceren specifieke veranderingen in de overvloed aan snoRNA's bij gewrichtsveroudering (SNORD88 en SNORD38 waren respectievelijk verlaagd en verhoogd) en artrose, wat wijst op het mogelijke gebruik van snoRNA's zoals SNORA73 en SNORD23 als een nieuwe biomarker voor gewrichtsveroudering, en SNORA64, SNORD46 en SNORD116 voor artrose, en SNORD18 voor zowel veroudering als artrose.

Conclusies
In de algemene discussie werden de in dit proefschrift beschreven gegevens besproken in relatie tot elkaar en met een blik op toekomstige richtingen voor snoRNA-onderzoek in kraakbeenweefsels. Daarnaast boden we een overzicht van de moleculaire interacties die in dit proefschrift zijn geïdentificeerd. Over het geheel genomen biedt het werk in dit proefschrift richtingen voor paden waarin snoRNA's functioneren bij de ontwikkeling en ziekte van chondrocyten.