Liu Sun

Cardiomyopathieën vormen een heterogene groep aandoeningen van de hartspier die worden gekenmerkt door structurele en/of functionele afwijkingen van het hart. Deze afwijkingen kunnen leiden tot progressieve contractiestoornissen, hartritmestoornissen, hartfalen en plotselinge hartdood. Een belangrijk deel van deze aandoeningen heeft een genetische oorzaak. Binnen deze groep neemt phospholamban (PLN)-gerelateerde cardiomyopathie een voorname plaats in. In het bijzonder is de pathogene variant PLN-R14del van groot klinisch belang, omdat deze in Nederland relatief frequent voorkomt en gepaard gaat met een verhoogd risico op zowel aritmogene als gedilateerde cardiomyopathie. De klinische expressie is echter sterk variabel: sommige dragers ontwikkelen al op jonge leeftijd ernstige ziekte, terwijl anderen pas laat of slechts in milde vorm symptomen krijgen. Deze heterogeniteit wijst erop dat de pathogenese van PLN-R14del-cardiomyopathie complex is en niet volledig kan worden verklaard vanuit één enkel mechanisme.

PLN is een klein regulatoir membraaneiwit dat in hartspiercellen de activiteit van de calcium pomp SERCA2a in het sarco(endo)plasmatisch reticulum (SR/ER) moduleert en daarmee de calcium opname vanuit het cytoplasma naar het SR/ER beïnvloedt. Lange tijd werd aangenomen dat de ziekte vooral het gevolg was van een verstoorde calciumhuishouding door afwijkende remming van SERCA2a door PLN. Recente resultaten, waaronder die in dit proefschrift, laten echter zien dat deze klassieke verklaring onvoldoende is. In plaats daarvan wijzen de experimentele en conceptuele bevindingen op een breder ziektebeeld, waarin verstoring van SR/ER-structuur, afwijkende eiwitorganisatie, ontregeling van proteostase en mutatie-specifieke cellulaire stressresponsen centraal staan. Daarmee verschuift het perspectief van een louter calcium-georiënteerd model naar een model waarin structurele en proteotoxische processen een doorslaggevende rol spelen in het ontstaan van ziekte.

In dit proefschrift stond daarom de vraag centraal welke moleculaire en pathofysiologische mechanismen ten grondslag liggen aan PLN-R14del-cardiomyopathie, en in hoeverre deze mechanismen aanknopingspunten bieden voor gerichte therapie. Hiertoe zijn vijf samenhangende onderzoekslijnen uitgewerkt: 1) een overzicht van klinisch beschreven PLN-varianten en hun vermoedelijke werkingsmechanismen; 2) een analyse van cardiale stress als mogelijke ziektemodifier; 3) de ontwikkeling van een induceerbaar muismodel om vroege ziekteprocessen te bestuderen; 4) een evaluatie van dosisafhankelijke effecten van PLN-gerichte antisense oligonucleotiden (ASO’s); 5) een in silico-analyse van de gevolgen van PLN-silencing voor verschillende PLN-complexen.

Het overzicht van bekende pathogene PLN-varianten in hoofdstuk 2, laat zien dat PLN-gerelateerde cardiomyopathie niet kan worden beschouwd als één uniforme aandoening. Verschillende varianten, waaronder truncaties, missense-mutaties en deleties zoals R14del, R9C, R9H, R9L en L39stop, leiden tot uiteenlopende fenotypes en waarschijnlijk ook tot verschillende onderliggende moleculaire defecten. De verschillen betreffen onder meer oligomerisatie, fosforylering, membraaninsertie, stabiliteit en eiwit-eiwitinteracties. Deze bevindingen onderstrepen dat niet alle PLN-varianten via hetzelfde mechanisme pathogeen zijn, en dat een uniforme therapeutische benadering waarschijnlijk niet voor alle dragers optimaal zal zijn. Dit heeft belangrijke implicaties voor toekomstige precisiegeneeskunde binnen het veld van erfelijke cardiomyopathieën.

Vervolgens is in hoofdstuk 3 onderzocht of verhoogde cardiale belasting het ontstaan van PLN-R14del-cardiomyopathie kan versnellen. Omdat dragers een sterke variatie vertonen in leeftijd van ziekte-onset en ernst, werd verondersteld dat bijkomende stressoren de drempel voor ziekteactivatie mogelijk kunnen verlagen. In een heterozygoot PLN-R14del-muismodel werd hiervoor drukbelasting geïnduceerd met transverse aorta constrictie (TAC). Hoewel TAC, zoals verwacht, leidde tot hypertrofie, fibrose en afname van de cardiale functie, veroorzaakte het geen versnelde vorming van de kenmerkende PLN-positieve SR/ER-clusters en ook geen extra mutatie-specifieke verslechtering bovenop de algemene respons op drukbelasting. Deze resultaten laten zien dat acute biomechanische belasting op zichzelf onvoldoende is om het specifieke ziekteproces van PLN-R14del te initiëren of te versnellen. Daarmee lijkt algemene cardiale stress niet een simpele verklaring voor de klinische heterogeniteit bij dragers te zijn.

Om de vroegste gebeurtenissen in het ziekteproces beter te kunnen bestuderen, werd in dit proefschrift een nieuw induceerbaar PLN-R14del-muismodel ontwikkeld, zoals beschreven in hoofdstuk 4. In dit model kon de expressie van wildtype PLN in volwassen cardiomyocyten synchroon worden omgezet naar expressie van PLN-R14del door middel van een tamoxifen-afhankelijke MerCreMer/LoxP-strategie. Hierdoor werd het mogelijk om ziekte-initiatie in de tijd gecontroleerd te volgen, zonder verstoring door ontwikkelingsprocessen of asynchrone expressie. Met dit model werd aangetoond dat de eerste detecteerbare afwijking bestaat uit het ontstaan van kleine PLN-positieve clusters in het SR/ER, die in de loop van de tijd uitgroeien tot de karakteristieke perinucleaire structuren die kenmerkend zijn voor deze cardiomyopathie. Belangrijk is dat deze structurele veranderingen al zichtbaar waren voordat duidelijke functionele achteruitgang of uitgesproken weefselafwijkingen optraden. Dit wijst erop dat SR/ER-misvorming een vroege en waarschijnlijk primaire gebeurtenis is in de pathogenese van PLN-R14del-cardiomyopathie.

Aanvullende transcriptoom en proteoom analyses van geïsoleerde cardiomyocyten uit dit induceerbare model lieten zien dat de vroege moleculaire veranderingen zich vooral op eiwitniveau manifesteren. Terwijl op mRNA-niveau relatief weinig veranderingen werden waargenomen, toonde het proteoom duidelijke verstoringen in SR/ER-gerelateerde processen. Daarbij werden onder meer veranderingen gevonden die passen bij activering of overbelasting van kwaliteitscontrolemechanismen in het endoplasmatisch reticulum, inclusief accumulatie van eiwitten die verband houden met ER-geassocieerde afbraak (ERAD). Ook werd een discrepantie zichtbaar tussen transcriptie en eiwitexpressie, wat wijst op een belangrijke rol voor post-translationele en/of afbraak-gerelateerde regulatie. Samen ondersteunen deze bevindingen het concept dat PLN-R14del-cardiomyopathie vroeg wordt gekenmerkt door verstoorde proteostase en een ontregeld intracellulair kwaliteitscontrolesysteem, gevolgd door latere transcriptoom veranderingen.

Een volgende centrale vraag was hoe verlaging van PLN-expressie therapeutisch ingrijpt op dit ziekteproces. In een homozygoot PLN-R14del-muismodel werd daarom het effect van verschillende doseringen van PLN-gerichte antisense oligonucleotiden onderzocht, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Deze experimenten toonden een duidelijke dosisafhankelijke bescherming: ASO-behandeling leidde tot verbetering van de cardiale functie, afname van remodellering, verlenging van de overleving en reductie van de pathologische PLN-positieve SR-clusters. Opvallend was echter dat de invloed op calciumdynamiek in mutante hartspiercellen beperkt bleef. In wildtype-cellen leidde PLN-depletie wel tot de verwachte versnelling van calcium- en contractiedynamiek, maar in PLN-R14del-hartspiercellen waren deze parameters reeds versneld en nauwelijks verder te verbeteren. Dit ondersteunt de conclusie dat het therapeutisch effect van PLN-ASO bij deze mutatie niet primair berust op herstel van calciumregulatie, maar vooral op herstel van SR-structuur.

Om beter te begrijpen waarom PLN-silencing vooral de structurele pathologie lijkt te beïnvloeden, is in hoofdstuk 6 aanvullend een in silico-model ontwikkeld waarin verschillende moleculaire vormen van PLN werden gesimuleerd: vrije monomeren, pentameren en SERCA-gebonden complexen. Deze simulaties lieten zien dat pentamere PLN-complexen gevoeliger zijn voor afname van totale PLN-concentratie dan vrije of SERCA-gebonden PLN-vormen. Dat is relevant, omdat juist de pentameer of geclusterde PLN-pool vermoedelijk sterk bijdraagt aan de abnormale intracellulaire accumulatie die bij PLN-R14del wordt gezien. De modelresultaten bieden daarmee een mechanistische verklaring voor de experimentele observatie dat PLN-silencing gepaard gaat met afname van abnormale clustering en herstel van SR-architectuur, terwijl de functionele SERCA-gerelateerde pool relatief langer behouden blijft. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat niet alle PLN-pools even gevoelig zijn voor afname van totale PLN-concentratie en dat de pentameer vorm, die het gevoeligst reageert, wellicht de meest pathologische component van het systeem is.

Gezamenlijk geven de resultaten in dit proefschrift aanleiding tot een herijking van het ziekteconcept van PLN-R14del-cardiomyopathie. In plaats van een aandoening die hoofdzakelijk wordt gedreven door afwijkende calciumremming van SERCA2a, komt er een beeld naar voren van een structurele proteinopathie van het sarco(endo)plasmatisch reticulum. Een centrale vroege gebeurtenis is de vorming van afwijkende PLN-positieve SR/ER-clusters, gevolgd door ontregeling van proteostase, activatie van intracellulaire stressroutes en uiteindelijk progressieve cardiale remodellering en functieverlies. Deze interpretatie verbindt de histologische, moleculaire, functionele en therapeutische bevindingen binnen dit proefschrift tot één samenhangend geheel.

De resultaten hebben daarnaast duidelijke translationele implicaties. Ten eerste ondersteunen zij verdere ontwikkeling van PLN-gerichte silencingstrategieën als veelbelovende therapeutische route, waarbij optimaliseren van de juiste dosering in de mens een belangrijk aandachtspunt zal zijn. Ten tweede benadrukken onze resultaten het belang van vroege detectie, omdat interventie vóór het ontstaan van irreversibele structurele schade waarschijnlijk het meest effectief zal zijn. Ten derde suggereren zij dat toekomstige biomarkerontwikkeling zich niet uitsluitend moet richten op globale hartfunctiemetingen, maar ook op vroege indicatoren van SR/ER-stress. Tot slot hebben we beschreven dat er PLN-variant-specifieke verschillen in onderliggend pathologische mechanismen kunnen zijn. Hiermee dient rekening te worden gehouden bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Samenvattend toont dit proefschrift aan dat de pathogene variant PLN-R14del leidt tot een vroeg optredende ontregeling van de intracellulaire SR/ER-organisatie, met daaropvolgende verstoring van proteostase en progressieve achteruitgang van hartspiercel functie. De bevindingen verschuiven het pathogenetische paradigma van een overwegend calcium-georiënteerde verklaring naar een model waarin structurele ontregeling en abnormale eiwitorganisatie centraal staan. Daarmee levert dit proefschrift niet alleen nieuwe inzichten in de biologie van PLN-R14del-cardiomyopathie, maar ook een basis voor de verdere ontwikkeling van mechanisme-gedreven en mutatie-specifieke behandelstrategieën.