Eligio Iannetti

Het belangrijkste doel van dit promotieonderzoek was het karakteriseren van de consequenties voor de cel van het disfunctioneren van mitochondriën. Dit is gedaan op fenotypische niveau voor Target Discovery en het testen van geneesmiddelen. Om dit te doen heb ik mij gericht op het ontwikkelen van nieuwe geautomatiseerde live-cell imaging technieken en de optimalisatie van cel-gebaseerde assays. Deze technieken zijn toegepast op de Primary Human Skin Fibroblasts (PHSF) afgenomen van zowel gezonde donoren als van patiënten met het Syndroom van Leigh (SvL). SvL is een ernstige neurologische afwijking die zich meestal openbaart in het eerste levensjaar door het versneld verliezen van mentale en motorieke capaciteiten. De patiënt overlijdt typisch binnen twee tot drie jaar, meestal door het falen van het ademhalingssysteem (Gerards et al., 2016). De bij de SvL patiënten afgenomen PHSF’s, die in deze studie gebruikt zijn, vertonen de meest voorkomende mitochondriale oxidatieve phosphorylyse (OXPHOS) enzym afwijking, namelijk het tekort aan het geïsoleerde complex I (Fassone and Rahman, 2012; Ma et al., 2013).

Hoofdstuk 1 introduceert de structuur, de functie en het disfunctioneren van mitochondriën van moleculair tot klinische niveau, inclusief de strategie om drugs te ontwikkelen. Het belang van mitochondriën op de gezondheid van de mens wordt benadrukt. Het concept van de mitochondriale morphofunctie wordt ook behandeld. Dit concept benadrukt de belangrijke interactie tussen vorm en functioneren. De morphofunctie is een essentiële indicator van de mitochondriale en algemene gezondheidstoestand van de cel, en wordt in elk hoofdstuk van dit proefschrift gemeten of bediscussieerd. Het hoofdstuk gaat verder met de beschrijving van de ernstige klinische aspecten van mitochondriale ziektes, specifiek het tekort aan CI en SvL zijn ziektebeelden waarvoor geen goede behandeling bestaat. De introductie wordt afgesloten met een overzicht van het proces van het ontwikkelen van geneesmiddelen met een focus op in vitro pre-klinisch werk. Cell-based fenotypisch screening wordt gepresenteerd als de belangrijkste methodologische aanpak die door farmaceutische bedrijven wordt gebruikt voor Target Discovery en het testen van drugs.

Er bestaat een groot aantal technologieën voor het evalueren van de bijdrage van mitochondriën aan ziektes en voor het uitvoeren van preklinisch in vitro geneesmiddelen ontwikkeling. Sommige van deze technieken zijn commercieel beschikbaar, andere alleen nog in het laboratorium. In Hoofdstuk 2 presenteer ik een kritisch overzicht van de literatuur over het gebruik van live-cell, hoge resolutie microscopie dat gebruikt wordt voor het karakteriseren van het disfunctioneren van mitochondriën door middel van fenotypische profilering gebaseerd op beelden. Gedetailleerde richtlijnen voor live-cell imaging technieken worden hier gepresenteerd om de ontwikkelde technieken in de experimentele hoofdstukken van dit proefschrift te introduceren. Vanuit dit perspectief bediscussieer ik een selectie van live-cell fluorescentie reporters, de gebruikte imaging strategie en modellen van de menselijk cel met hun voor- en nadelen. We presenteren ook een overzicht van live-cell toepassing van microscopie die gebruikt worden voor het detecteren van cellulaire fenotypes gekoppeld aan ziektes en voor het uitvoeren van cel gebaseerde screening van geneesmiddelen.

Hoofdstuk 3 richt zich op hoe mitochondriaal morphofunction kan worden bestudeerd en gecombineerd met high-content en high-troughput strategieën. Het hoofdstuk behandelt verschillende toepassingen hiervan, die worden gebruikt om genetische en door geneesmiddelen veroorzaakte effecten op het niveau van individuele organellen, cellen en cel populaties te analyseren. In Hoofdstuk 4 presenteren wij een nieuw protocol dat ontwikkeld is om gemultiplexde high-content analyses van mitochondriale morphofunctie uit te voeren. Dit maakt het mogelijk om de mitochondriale morphofunctie en de cellulaire en nucleaire parameters in de PHSF’s onbevooroordeeld en geautomatiseerd te kwantificeren. Cellen werden gekweekt op 96-well kweekplaten en verkleurd met drie fluorescentie kleurstoffen die gericht zijn op mitochondriën, cytosol en kernen. Beelden van multi-spectrale fluorescentie zijn verkregen met geautomatiseerde microscopie waaruit de waarde van 44 descriptoren geëxtraheerd zijn. Deze data werd vervolgens onderworpen aan univariate, bivariate en multivariate analyse. Hoewel dit protocol specifiek voor PHSF’s ontwikkeld is kan het ook worden toegepast op andere cel types. In Hoofdstuk 5 wordt dit protocol toepast op het HT22 neuronaal cel model. Mitochondriale morphofunctionele analyse werd gebruikt om de flexibiliteit van het cellulaire metabolisme te analyseren met lage-geleiding Ca2+-geactiveerde K kanalen om vervolgens de fenotypische consequenties te onderzoeken. HT22 werd behandeld met de chemische verbinding CyPPA om farmacologische SK-activering te induceren. Bij aanwezigheid van glucose in het cultuur medium produceren veel in vitro gekweekte cel modellen bijna alle ATP via glycolyse in plaats van met het mitochondriale OXPHOS systeem (Crabtree, 1929). Daarom is het een algemeen gebruikte experimentele opzet om glucose te vervangen door galactose in het cultuur medium om pathologische mitochondriale fenotypes te induceren of te versterken (Robinson et al., 1992; Rossignol et al., 2004). Deze strategie forceert dat de ATP productie afhangt van het mitochondriale metabolisme, dat glycolyse opregulering wordt voorkomen en dat metabolische flexibiliteit wordt beperkt (Rossignol et al., 2004). Om de cellulaire compensatie mechanismes van de inhibitie van glycolytische opregulering te beperken, hebben wij in Hoofdstuk 5 de mitochondriale morphofunctionele analyse van de met CyPPA behandelde HT22 cellen uitgevoerd in galactose- en glucose gebaseerde media.

In Hoofdstuk 6 gebruiken wij ook de op galactose gebaseerde medium strategie waarmee een metabolische stress wordt opgewerkt die de afwijkingen van het PSHF CI tekort verstrekt. Wij hebben een cellulaire en mitochondriale fenotype karakterisering uitgevoerd van de cellen met een mitochondriale ziekte die in een galactose gebaseerd medium groeien en die vergeleken met cellen die in een glucose gebaseerd medium groeien. We onderzochten de levensvatbaarheid van de cel, de mitochondriale morfofunctie, de reactieve zuurstof species en de ATP-homeostase. Een paneel van 6 cellijnen werd gebruikt, drie afgeleid van gezonde donoren en drie van patiënten met LS die mutaties vertonen in de CI genen (NDUFS7, NDUFS8, NDUFVN) gecodeerd in het nucleaire DNA (n-DNA). Na een optimalisaties van het celcultuur protocol en van de samenstelling van het op glucose gebaseerde medium, stierven de LS fibroblasten in het galactose medium terwijl de control cellen bleven leven. De sterfte onder LS-cellen werd afhankelijk van de dosering geremd door pyruvaat, malaat, oxaloacetaat, α-ketoglutaraat, aspartaat en exogeen NAD+ (eNAD), maar niet door lactaat, succinaat, α-ketobutyraat en uridine. Pyruvaat en eNAD verhoogde het gehalte van cellulair NAD+ in de met galactose behandelde LS-cellen in verschillende mate. Co-incubatie studies lieten zien dat de door pyruvaat geinduceerde redding niet primair door NAD wordt gemedieerd. De vervanging van glucose door galactose in de LS-cellen verhoogde de mitochondriale fragmentatie en massa, depolariseerde de mitochondriale membraan potentiaal (∆ψ, verhoogde het H2DCFDA-oxiderende ROS-niveau, verhoogde de vorming van de mitochondriale ATP en verminderde het totale cellulaire ATP-gehalte. Deze afwijkingen werden op een verschillende manier gered door pyruvate en eNAD wat de conclusie ondersteunt dat deze verbindingen via verschillende mechanismes de sterfte van LS-cellen veroorzaakt door galactose beperken. Deze bevindingen leggen een nieuwe cel-gebaseerde strategie vast voor het testen van interventies en versterken ons begrip van de pathofysiologie van het tekort aan CI.

Hoofdstuk 7 presenteert net als hoofdstuk 6 een fenotypische en moleculaire karakterisering van door CI-tekort geïnduceerde afwijkingen in PSHF’s, onder een conditie van stress. In deze studie wordt een redox stress opgelegd door de cellen te behandelen met L-buthionine-(SIR)-sulfoximine (BSO) wat de concentratie van de belangrijkste cellulaire oxidant, glutathion (GSH), vermindert. Net als in hoofdstuk 6 werden zes cellijnen gebruikt, drie van gezonde donoren en drie van patiënten met LS met mutaties in de CI genen ((NDUFS7, NDUFS2, NDUFVN). De NDUFS7 cellijn was dezelfde als in hoofdstuk 6, echter de ander twee wijken af: de NDUFS2 was een andere cellijn met een mutatie in een ander gen van het CI, NDUFVN heeft een andere mutatie op hetzelfde gen van het CI. We hebben eerder laten zien dat de GSH synthese-inhibitor BSO het cellulaire GSH gehalte in dezelfde mate verminderd in PSHF’s van LS patiënten als in gezonde controle donoren. Het was interessant dat de BSO behandeling de levensvatbaarheid van cellen van LS patiënten sterk reduceert (allemaal met een geïsoleerde mitochondriale CI tekort), terwijl CT cellen levensvatbaar bleven. De oorzaak voor dit verschil in invloed is nog niet bekend. In dit laatste hoofdstuk voerden wij ook een fenotypische en moleculaire profilering uit van LS- en CT cellen om het effect van BSO te bestuderen voordat de celsterfte werd geïnduceerd. De incubatie gedurende 24 uur van PSHF’s met een niet-giftige BSO-concentratie (1 µM) verminderde de mitochondriale en cytosolische GSH-niveaus in LS en CT cellen op dezelfde wijze. Geen afwijkingen in de mitochondriale morfofunctie, het cellulaire ATP gehalte of de cellulaire lipide peroxidatie toestand werd geobserveerd tot 2 uur voordat de cel sterfte werd geinduceerd. Als de lipide peroxidatie toestand echter op een latere tijdstip (12 of 18 uur) werd gemeten werd een uitbarsting waargenomen tegelijkertijd met een vermindering van de levensvatbaarheid van de cel die geidentificeerd kan worden als een LS-specifiek pathologisch fenotype. We hebben eerder gedemonstreerd dat KH176m, het metaboliet van een nieuwe geneesmiddel KHN7S dat in de klinisch fase is, de BSO-geinduceerde celsterfte volledig stopt. Hier geven wij voorlopige bewijs dat deze celsterfte wordt vergezeld door een verhoogde lipide peroxidatie, wat KH176m kan voorkomen. De effectiviteit van KH176m werd ook vergeleken met Ferrosttin-1, de eerste geindentificeerde inhibitor van ferroptose, een celsterfte die ook afhankelijk is van lipide peroxidatie. Deze verkennende studie benadrukt de causale rol van lipide peroxidatie op de door BSO veroorzaakte sterfte van cellen van LS patienten en verstrekt ons begrip van het werkingsmechanisme van KH176m.