Alejandra Martinez Chavez

Hoofdstuk 4 rapporteert een snelle bioanalytische methode voor de gelijktijdige kwantificering van irinotecan en SN-38 in muisplasma en weefselhomogenaten met behulp van High-Performance vloeistofchromatografie met Fluorescentiedetectie (HPLC-FL). Deze methode is geoptimaliseerd om specifiek preklinische studies van het metabolisme van irinotecan in SN-38 door carboxylesterase-enzymen te ondersteunen. De selectiviteit, lineariteit, nauwkeurigheid en precisie van de methode in het concentratiebereik van 7,5 tot 1500 ng/mL voor irinotecan en van 5 tot 1000 ng/mL voor SN-38 werd aangetoond. Ten slotte is de toepasbaarheid van deze methode in een farmacokinetische studie van irinotecan en SN-38 met behulp in vivo muismodellen bewezen. Deel II: De impact van geneesmiddeltransporters en metaboliserende enzymen op de farmacokinetiek van cycline-afhankelijke kinaseremmers Geneesmiddeltransporters en geneesmiddel metaboliserende enzymen kunnen de dispositie van substraatgeneesmiddelen beïnvloeden met klinisch relevante (farmacodynamische) gevolgen. Dus, met behulp van in vitro studies en verschillende genetisch gemodificeerde muismodellen, onderzoekt deel II van dit proefschrift de rol van efflux- (ABCBN en ABCG2) en influxtransporters (OATPN) en cytochroom P4SO 3A (CYPPA) enzymen in de farmacokinetiek en weefseldistributie van CDK-remmers. Hoofdstuk 5 onderzoekt de effecten van de efflux-transporters ABCBN en ABCG2 en van CYPPA op de farmacokinetiek van de CDK4/6 remmer ribociclib. In vitro werd ribociclib efficiënt getransporteerd door humaan ABCBN. In vivo werd de hersenpenetratie van ribociclib drastisch beperkt door ABCBN in de bloed- hersenbarrière, maar gelijktijdige toediening van elacridar kon dit proces volledig omkeren. De resultaten suggereerden verder dat ABCBN een belangrijke rol zou kunnen spelen bij de eliminatie van ribociclib. Bovendien toonde deze studie aan dat humaan CYPPA4 ribociclib uitgebreid kan metaboliseren en de orale biologische beschikbaarheid ervan sterk kan beperken. De inzichten uit deze studie kunnen nuttig zijn om de klinische toepassing van ribociclib verder te optimaliseren, met name voor de behandeling van (uitgezaaide) hersentumoren. Hoofdstuk 6 onderzoekt of de actieve metabolieten van abemaciclib (M2, M2O en MN8) substraten zijn van de effluxtransporters ABCBN en ABCG2. Daarnaast bekijkt dit hoofdstuk de impact van deze transporters en van CYPPA op de farmacokinetiek en weefseldistributie van abemaciclib en zijn actieve metabolieten. In vitro werd abemaciclib efficiënt getransporteerd door humaan ABCBN en muis Abcg2, en in geringe mate door humaan ABCG2, en de actieve metabolieten waren zelfs betere transportsubstraten van deze effluxtransporters. ABCBN en ABCG2 hadden geen invloed op de plasmablootstelling van abemaciclib en M2O, maar de AUC en de C 0-24h max van M2 namen significant toe in de afwezigheid van Abcb1a/1b en Abcg2, waarbij Abcb1a/1b een dominante rol leek te spelen. Bovendien nam de hersenpenetratie van abemaciclib, M2 en M2O dramatisch toe, respectievelijk (ten minste) 25-, 4- en 60-voudig wanneer beide transporters waren geïnactiveerd, en in mindere mate bij de enkelvoudige Abcb1- of Abcg2-deficiënte muizen. Ook was de herwinning van abemaciclib en zijn metabolieten vanuit de inhoud van de dunne darm sterk verminderd bij Abcb1a/1b;Abcg2 muizen, en deze effecten waren eveneens minder uitgesproken -/- bij de single knock-out muizen. Onze resultaten laten zien dat Abcb1a/1b en Abcg2 samen de hersenpenetratie van abemaciclib en zijn actieve metabolieten beperken, en ook dat ze deelnemen aan de hepatobiliaire of directe intestinale eliminatie van deze verbindingen. Daarnaast verminderde het humane CYPPA4 de abemaciclib plasma AUC en de C met respectievelijk 7,5- en 5,6-voud drastisch, en het bleek actiever 0-24h max te zijn in de vorming van M2 en M2O dan het muis Cyp3a. De inzichten die in deze studie zijn verkregen kunnen helpen om de klinische ontwikkeling van abemaciclib te optimaliseren, met name voor de behandeling van hersentumoren. Hoofdstuk 7 onderzoekt de rol van de multidrug efflux en uptake transporters ABCBN, ABCG2 en OATPNA/1B, en het geneesmiddelmetaboliserende enzym CYPPA in de dispositie van milciclib. In vitro werd milciclib getransporteerd door muis Abcg2. De plasmablootstelling aan milciclib werd niet significant beïnvloed door effluxtransporters. De Oatp1a/1b opnametransporter had slechts een kleine invloed op de milciclib plasma AUC en C . Milciclib vertoonde een goede hersenpenetratie, zelfs bij wildtype 0-24h max muizen (hersen-tot-plasmaverhouding van 1,2), maar dit werd verder verhoogd met een factor 5,2 wanneer zowel Abcb1 als Abcg2 waren geïnactiveerd, en in mindere mate bij enkelvoudige Abcb1- of Abcg2 -deficiënte muizen. De plasma-AUC van 0-8h milciclib nam 1,9-voudig toe in Cyp3a -muizen, maar nam slechts 1,3-voudig af na −/− overexpressie van humaan CYPPA4. Onze gegevens geven dus aan dat ABCBN en ABCG2 samen de penetratie van milciclib in de hersenen beperken. De geringe impact van OATPN en CYPPA zou klinisch gunstig kunnen zijn voor milciclib, aangezien het risico op onbedoelde geneesmiddelinteracties of interindividuele variatie in CYPPA4- activiteit wordt verminderd. Deel III: Klinische farmacokinetiek en farmacodynamiek van de cycline- afhankelijke kinaseremmers Ten slotte wordt in Hoofdstuk 8 de klinische farmacokinetiek en farmacodynamiek van de goedgekeurde CDK4/6-remmers (palbociclib, ribociclib en abemaciclib) besproken. Hier wordt de farmacokinetiek van deze geneesmiddelen in normale en specifieke populaties beschreven, evenals enkele extrinsieke factoren die hierop van S invloed zijn, waaronder het voedseleffect en de interactie met andere geneesmiddelen. Overeenkomsten tussen de farmacokinetiek van deze geneesmiddelen omvatten hun uitgebreide metabolisme door CYPPA4, hun hersenpenetratie beperkt door effluxtransporters en hun grote interindividuele variabiliteit in blootstelling. Verder belicht dit hoofdstuk de blootstelling-respons en blootstelling-toxiciteitsrelaties. Consistent voor al deze geneesmiddelen wordt hoge blootstelling geassocieerd met een verhoogd risico op neutropenie, en voor ribociclib ook met gecorrigeerde QT- verlenging. Voor abemaciclib is een duidelijke blootstelling-werkzaamheidsrelatie beschreven, terwijl voor palbociclib en ribociclib blootstelling-responsanalyses nog geen uitsluitsel hebben kunnen geven. Concluderend kunnen de inzichten in verschillende aspecten van de CDK-remmers beschreven in dit proefschrift van nut zijn om het klinische gebruik van abemaciclib, palbociclib en ribociclib te optimaliseren. Bovendien kan dit mogelijk bijdragen aan de verdere ontwikkeling en toepassing van deze geneesmiddelen en milciclib. Uiteindelijk kan deze informatie hopelijk leiden tot CDK-behandelingen met verbeterde werkzaamheid en veiligheid. Resumen en español Resumen en español El cáncer continúa siendo un problema de salud mundial, y se espera que su incidencia y mortalidad aumenten en los próximos años. Los nuevos tratamientos contra el cáncer se han enfocado en el desarrollo de fármacos de terapia molecular dirigida, los cuales han demostrado tener una mayor eficacia y una toxicidad reducida comparadas con los fármacos citotóxicos tradicionales. Las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) han sido reconocidas como blancos potenciales para tratamientos contra el cáncer, debido a que éstas, cuando son activadas por ciclinas, pueden controlar putos críticos del ciclo celular. Hasta ahora, tres fármacos que inhiben selectivamente a CDK4 y CDKS (palbociclib, ribociclib y abemaciclib) han sido aprobados por agencias regulatorias, y actualmente están indicados para el tratamiento de cáncer avanzado o metastásico de mama. Asimismo, otros inhibidores de CDK con diferente especificidad están siendo investigados en estudios clínicos. Esta tesis aborda varios aspectos farmacológicos de los inhibidores de CDK, incluyendo su bioanálisis (Parte I), farmacocinética preclínica (Parte II) y clínica (Parte III), enfocándose principalmente en los inhibidores de CDK4/6 ya aprobados: abemaciclib, palbociclib y ribociclib. Asimismo, esta tesis también abarca milciclib, un fármaco inhibidor de CDK2 que actualmente se encuentra en investigación clínica para el tratamiento de algunos cánceres. Parte I: bioanálisis de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina Debido a que los métodos bioanalíticos son esenciales y críticos para dirigir y realizar apropiadamente estudios preclínicos y clínicos con fármacos, la parte I de esta tesis se enfoca en el desarrollo y validación de métodos bioanalíticos para el análisis cuantitativo de los inhibidores de CDK. La validación de estos métodos se realizó siguiendo las guías de validación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de Estados Unidos y de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA). Los métodos bioanalíticos descritos en la parte I de esta tesis se usaron para dar soporte a los estudios preclínicos realizados en la parte II. El capítulo 1 describe el desarrollo y la validación de un método bioanalítico para la cuantificación de los tres inhibidores de CDK4/6 aprobados (abemaciclib, palbociclib y ribociclib) en matrices biológicas humanas y murinas usando cromatografía de líquidos con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Este método fue completamente validado en plasma humano y parcialmente validado en fluidos murinos, incluyendo plasma y tejidos homogeneizados de hígado, riñón, bazo, cerebro e intestino delgado. Para evaluar el desempeño del método en los tejidos homogeneizados, se utilizó una estrategia “fit-for-purpose” fue usada. El método resultó ser lineal, exacto y preciso para la cuantificación de abemaciclib, palbociclib y ribociclib en todas las matrices biológicas. También, en este capítulo se examinó la estabilidad de los tres analitos en todas las matrices biológicas en diferentes condiciones de almacenamiento y de procesamiento, en donde palbociclib y ribociclib Resumen en español resultaron ser inestables en ciertos tejidos homogeneizados, por lo que las condiciones fueron modificadas con la finalidad de incrementar la estabilidad de almacenamiento y procesamiento de la muestra. La aplicabilidad de este método fue demostrada a través de un estudio de farmacocinética preclínica de ribociclib, en donde se detectó un nuevo metabolito con la misma transición m/z que el fármaco. Por otra parte, en humanos, el metabolismo de abemaciclib conlleva a la formación de tres metabolitos activos (M2, M2O y MN8), cuya potencia, que es comparable a la de abemaciclib, y abundancia relativa en plasma humano, hacen que estos compuestos sean de importancia clínica, ya que probablemente contribuyen, en general, a la eficacia y seguridad clínicas de abemaciclib. Por consiguiente, el método presentado en el capítulo 2 incluye el bioanálisis simultaneo de estos metabolitos y abemaciclib, mediante el uso de un método optimizado por cromatografía de líquidos acoplado a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). Mientras que para la cuantificación en plasma humano se realizó una validación completa de este método, en plasma murino el método fue parcialmente validado. Este método fue exitosamente aplicado en un estudio de farmacocinética preclínica, en donde se identificaron y cuantificaron abemaciclib y sus metabolitos activos, encontrándose diferencias interespecie entre las matrices humanas y murinas, especialmente en la formación de M2O, donde se detectaron isómeros de este compuesto en plasma murino, pero no en plasma humano, lo cual fue confirmado mediante un análisis de espectrometría de masas de alta resolución. Posteriormente, en el capítulo 3 se expone un método versátil basado en LC-MS/MS para el análisis cuantitativo de milciclib en múltiples matrices biológicas, con la finalidad de contribuir a su desarrollo clínico y preclínico. Para esto, se seleccionó un rango amplio de concentraciones y el método fue validado en varias matrices biológicas, incluyendo plasma humano y murino, y homogeneizados de cerebro, riñón, hígado, intestino delgado y bazo de ratón, además de medio de cultivo celular. Se realizó una validación completa del método en plasma humano y una validación parcial en las otras matrices biológicas. El pretratamiento de la muestra utilizado produjo una extracción eficiente del analito, logrando entre un 95 y 100% de recobro. El uso de plasma humano como matriz sustituta para cuantificar milciclib en medio de cultivo celular y en matrices biológicas de ratón resultó con precisión y exactitud aceptables, aunque para las muestras en medio de cultivo celular fue necesario diluirlas con plasma humano antes del pretratamiento de la muestra. Todos los parámetros de S desempeño del método cumplieron con el criterio de aceptación recomendado por las guías de validación, excepto el carry-over, el cual fue ligeramente mayor (22.9% del límite de cuantificación) del límite recomendado (20%), por consiguiente, se tomaron medidas adicionales para asegurar la integridad de los resultados. Adicionalmente, se evaluó la estabilidad de milciclib en todas las matrices biológicas, donde algunas inestabilidades del analito fueron encontradas en algunas matrices bajo ciertas Resumen en español condiciones, por lo que para muestras en estas matrices se incluyeron recomendaciones específicas para su almacenamiento y procesamiento. En el capítulo 4 se reporta un método bioanalítico rápido para la cuantificación simultánea de irinotecan y SN-38 en plasma y tejidos homogeneizados de ratón usando cromatografía de líquidos de alta eficiencia con detector de fluorescencia (HPLC-FL). Este método fue optimizado para aplicarse específicamente en estudios preclínicos sobre la conversión de irinotecan a SN-38 por medio de las enzimas carboxilesterasas. Se demostró la selectividad, linealidad, exactitud y precisión del método en un rango de concentraciones de 7.5 a 1500 ng/mL y de 5 a 1000 ng/mL para irinotecan y SN-38, respectivamente. Finalmente, se mostró la aplicabilidad del método en un estudio farmacocinético de irinotecan y SN-38 usando modelos in vivo en ratones. Parte II: Efecto de los transportadores y enzimas metabolizadoras de fármacos en la farmacocinética de los inhibidores de quinasas dependiente de ciclina Los transportadores de membrana y las enzimas metabolizadoras de fármacos pueden influir en la disposición en el organismo de fármacos sustrato, y pueden llegar a tener consecuencias farmacodinámicas clínicamente relevantes. Por lo tanto, la parte II de esta tesis investiga la función de los transportadores de eflujo (ABCBN y ABCG2) e influjo (OATPN) y de la enzima citocromo P4SO 3A (CYPPA) en la farmacocinética y la distribución en tejidos de los inhibidores de CDK, mediante el uso de modelos in vitro e in vivo, en este último incluyendo diversos modelos de ratones modificados genéticamente. Así, el capítulo 5 examina los efectos de los transportadores de eflujo ABCBN y ABCG2, y de CYPPA4 en la farmacocinética de ribociclib, un inhibidor de CDK4/6. In vitro, ribociclib fue transportado por ABCBN humano; asimismo, en estudios in vivo, la penetración cerebral de ribociclib fue drásticamente limitada por la actividad de ABCBN en la barrera hematoencefálica, no obstante, la coadministración con elacridar pudo revertir en su totalidad este proceso. Los resultados, además, mostraron que el transportador ABCBN podría tener un papel importante en la eliminación de ribociclib. Adicionalmente, este estudio demostró que CYPPA4 puede metabolizar extensivamente a ribociclib y restringir biodisponibilidad oral de este fármaco. Los conocimientos generados en este estudio podrían ser útiles para optimizar el uso de ribociclib en la clínica, especialmente para el tratamiento de tumores cerebrales metastásicos. Por otra parte, el capítulo 6 investiga si los metabolitos activos de abemaciclib (M2, M2O y MN8) son sustratos de los transportadores de eflujo ABCBN y ABCG2. Además, este capítulo establece el impacto de estos transportadores y de la enzima CYPPA en la farmacocinética y la distribución en tejidos de abemaciclib y de sus metabolitos activos. En estudios in vitro, abemaciclib fue transportado eficientemente por ABCBN humano, Abcb2 murino, y ligeramente por ABCG2 humano, asimismo, los metabolitos Resumen en español activos de abemaciclib resultaron ser incluso mejores sustratos de estos transportadores. In vivo, ABCBN y ABCG2 no tuvieron efecto en la exposición plasmática de abemaciclib y de su metabolito M2O, mientras que el área bajo la curva de 0 a 24 h (AUC ) y la concentración plasmática máxima (C ) de M2 aumentó 0-24h max significativamente en ausencia de Abcb1a/1b y Abcg2, donde Abcb1a/1b parece tener un papel más dominante. Asimismo, en ausencia de ambos transportadores, la penetración cerebral de abemaciclib, M2 y M2O aumentó al menos 25, 4 y 60 veces, respectivamente, y en menor grado, en ratones deficientes únicamente de un transportador: Abcb1a/1b o Abcg2. De la misma forma, el recobro de abemaciclib y sus metabolitos en el lumen intestinal se redujo en gran medida en ratones Abcb1a1b;Abcg2 , y en menor grado en ratones deficientes de un solo transportador. -/- Estos resultados sugieren que ambos transportadores limitan cooperativamente la penetración cerebral de abemaciclib y sus metabolitos activos, y que, además, participan en su eliminación hepatobiliar o intestinal directa. Por otra parte, la enzima CYPPA4 redujo drásticamente la AUC y C plasmática alrededor de 7.5 y 5.6 veces, 0-24h max respectivamente, y además demostró ser más activa en la formación de M2 y M2O comparada con la enzima murina Cyp3a. La información generada en este estudio podría ayudar a optimizar el desarrollo clínico de abemaciclib, especialmente en el tratamiento de cánceres cerebrales. El capítulo 7 explora la función de los transportadores de eflujo e influjo ABCBN, ABCG2 y OATPNA/1B, y de la enzima metabolizadora de fármacos CYPPA en la disposición de milciclib. En los resultados de este estudio, se encontró que milciclib fue transportado por el Abcg2 murino in vitro, no obstante, los niveles plasmáticos de milciclib no se alteraron de forma significativa por los transportadores de eflujo, mientras que los parámetros farmacocinéticos AUC y C fueron alterados mínimamente por 0-24h max Oatp1a/1b. Por otro lado, milciclib mostró buena penetración cerebral, incluso en los ratones wild-type (relación cerebro/plasma igual a 1.2), la cual incrementó 5.2 veces en ausencia ambos transportadores de eflujo (Abcb1 y Abcg2) y, en menor grado, en ratones deficientes de un sólo transportador. Por último, la AUC plasmática de 0-24h milciclib aumentó 1.9 veces en ratones Cyp3a , pero únicamente disminuyó 1.3 veces -/- ratones con sobreexpresión de la enzima CYPPA4 humana. En resumen, estos datos indicaron que ABCBN y ABCG2 limitan cooperativamente la penetración cerebral de milciclib, mientras que los efectos menores de OATPN y CYPPA4 en la farmacocinética de milciclib podrían ser clínicamente favorables, ya que disminuiría el riesgo de interacciones fármaco-fármaco no deseadas, o de variaciones interindividuales por la S actividad de CYPPA4. Parte III: Farmacocinética y farmacodinamia clínica de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina Finalmente, en el capítulo 8 se resume la farmacocinética y la farmacodinamia clínica de los inhibidores de CDK4/6 aprobados (palbociclib, ribociclib y abemaciclib), Resumen en español incluyendo su farmacocinética en poblaciones normales y específicas, así como también la influencia de algunos factores extrínsecos, como el efecto de los alimentos y la interacción con otros medicamentos. Algunas similitudes encontradas entre estos inhibidores de CDK4/6 comprendieron el metabolismo extensivo debido a CYPPA4, su penetración cerebral limitada por los transportadores de eflujo, y su gran variabilidad interindividual en niveles plasmáticos. Por otro lado, este capítulo resalta las relaciones exposición-respuesta y exposición-toxicidad de estos fármacos, en las cuales para abemaciclib existe una relación exposición-respuesta evidente, mientras que para palbociclib y ribociclib, los análisis exposición-respuesta permanecen aún inconclusos. En cuanto a la relación exposición-toxicidad, consistentemente para estos tres fármacos, la alta exposición está asociada con un riesgo aumentado de neutropenia, y para ribociclib también con una prolongación del intervalo QT corregido. En conclusión, los conocimientos aportados en esta tesis sobre los diferentes aspectos de los inhibidores de CDK podrían ser útiles para optimizar y expandir el uso clínico de abemaciclib, palbociclib y ribociclib, y asimismo, contribuir potencialmente al desarrollo clínico de milciclib, esperando que esta información pueda contribuir al desarrollo de tratamientos con inhibidores de CDK más eficaces y seguros.