Nina Wijnands

Introductie

Ontstekingen en bloedvergiftiging, ook wel sepsis genaamd, vormen een groot probleem voor de gezondheidszorg, omdat deze aandoeningen gepaard gaan met een verhoogde kans op ziekte en sterfte. Dit zijn belangrijke onderliggende oorzaken in het ontstaan van functiestoornissen in vele organen tegelijk, ook wel multi-orgaan falen (MOF) genaamd. MOF ontstaat doordat de doorbloeding van deze organen verstoord raakt. Vooral de doorbloeding van de kleinste vaten, de microcirculatie genaamd, is belangrijk, met name die in het slijmvlies (mucosa) van de darm. Het darmslijmvlies beschermt het lichaam tegen ziekteverwekkers die via het maag-darmkanaal naar binnen kunnen komen. Een misschien nog belangrijkere taak van het darmslijmvlies is dat het zorgt voor de opname van essentiële voedingsstoffen, zoals bijvoorbeeld het aminozuur arginine. Arginine is het enige molecuul waar onze stofwisseling stikstofmonoxide (NO) van kan maken. NO is een van de belangrijkste vaatverwijdende stoffen. In weefsels met ontstekingen en tijdens bloedvergiftiging, concurreren ontstekingscellen (onder andere macrofagen) en de cellen die de bloedvaten bekleden, de endotheelcellen, om het gebruik van arginine voor deze NO productie. Een lage, maar continue aanwezige NO productie in bloedvaatwand is nodig voor een goede doorstroming, terwijl een hoge NO productie zorg draagt voor vernietiging van schadelijke micro-organismen, maar ook schade toebrengt aan het ontstoken weefsel. Op grond van deze kennis leek het logisch de beschikbaarheid van arginine te verhogen door extra arginine toe te dienen of de afbraak van arginine te verminderen. In de praktijk bleken de resultaten van deze aanpak in eerdere onderzoeken echter teleurstellend. Een oorzaak voor deze teleurstellende resultaten zou het gebruik van een verkeerd experimenteel model kunnen zijn. In de tot nu toe gebruikte modellen werden muizen ingespoten met een bloedvergiftiging veroorzakende stof, endotoxinen of lipopolysaccharide (LPS), maar omdat deze proeven van korte duur waren ontstond helemaal geen tekort aan arginine. Het eerste doel van ons onderzoek was dan ook het ontwikkelen van een langdurig model waarin wel een tekort aan arginine zou ontstaan en dat beter vergelijkbaar was met de zieke mens, waarin ook sprake is van een tekort aan arginine. Verder vonden wij het belangrijk niet alleen een nieuwe behandeling te vinden voor deze arginine tekorten, maar tevens meer kennis te verkrijgen over de regulering van de stofwisseling van arginine en NO tijdens deze aandoeningen. Het overkoepelende doel van dit proefschrift was dan ook het ontrafelen van de rol van de enzymen die betrokken zijn bij de aanmaak (argininosuccinate synthetase; ASS) en de afbraak van arginine (arginase, NO-synthase 2 en -3) tijdens ontstekingen en bloedvergiftiging.

Model ontwikkeling

In hoofdstuk 4 wordt het muismodel met langdurige blootstelling aan endotoxinen beschreven. In dit model werd gedurende 18 uur endotoxinen in de bloedbaan toegediend, een stof die verantwoordelijk is voor de verschijnselen van bloedvergiftiging. In dit model werd vastgesteld dat de concentratie arginine na 12 uur ontoereikend werd voor een normale doorbloeding, hetgeen vergelijkbaar is met de arginine afname in de zieke patiënt. Tevens werden de best bruikbare technieken en methoden getest om de doorstroming van het darmslijmvlies en de aanmaak van NO te meten in dit nieuwe model (tweede doel). Dit heeft geleid tot het meten van de microcirculatie in de darmmucosa van het middelste deel van de dunne darm, het jejunum, met een SDF-camera. Deze camera is alleen gevoelig voor licht dat door het hemoglobine, het zuurstofdragende eiwit in bloedcellen, wordt tegengehouden, zodat kleine bloedvaten als donkere structuren zichtbaar zijn. In onze studie wilden we natuurlijk ook weten hoeveel NO geproduceerd wordt in zieke en controle muizen, en of arginine toediening leidt tot meer NO productie. Het meten van NO is mogelijk doordat NO ingevangen kan worden in een in de bloedbaan ingespoten chemisch complex en wordt daarom ook wel NO "spin trapping" genaamd. Door de gevormde hoeveelheid van dit complex in een magnetisch veld te meten kan de productie van NO bepaald worden. In ons diermodel was sprake van een verminderde NO productie in de darm tijdens blootstelling aan endotoxinen (hoofdstukken 6-9). Met een fluorescerend koperhoudend complex dat NO bindt (Cu FL2E) in de cellen die de bloedvaten aan de binnenzijde bekleden (zgn. Endotheelcellen), konden we ook de NO productie daar meten. Ook in deze metingen zagen wij een duidelijk verminderde NO productie in dieren met blootstelling aan endotoxinen. Samenvattend laten de resultaten van hoofdstuk 4 zien dat het door ons ontwikkelde diermodel en de gebruikte technieken geschikt zijn om de bijdragen van de belangrijkste enzymen voor de productie van arginine en NO, en de effectiviteit van de door ons bedachte behandelingen voor een verbeterde doorbloeding van het darmslijmvlies te toetsen (hoofdstukken 5-9).

Rol van de ontstekingsreactie

Een belangrijke oorzaak van het tekort aan arginine tijdens een ontsteking is het verhoogde verbruik van arginine. Het verbruik van arginine neemt toe doordat de activiteit van 2 van de enzymen die arginine omzetten (arginase-1 en NOS2) verhoogd is in ontstekingen. Dit leidt tot een verminderde beschikbaarheid van arginine voor NO productie (via NOS3) in de (endotheel)cellen die de bloedvaten aan de binnenzijde bekleden en een verminderde doorstroming van die vaten. Als model hebben wij de effecten van het inspuiten van een gezuiverde arginase oplossing in de bloedbaan van muizen bestudeerd (derde doel). In hoofdstuk 5 laten we zien dat deze ingreep tot een snelle verlaging van de arginine concentratie in de bloedbaan en weefsels en een snelle vermindering van de doorbloeding van het darmslijmvlies leidt. Het toedienen van extra arginine aan deze muizen leidde echter niet tot een verbetering van het ziektebeeld, terwijl toediening van citrulline, een voorloper van arginine, wel dat effect had. Deze uitkomst was voor ons een aanwijzing dat citrulline toediening een veelbelovende ingreep is voor toestanden waarin de afbraak van arginine, in dit geval door arginase, in korte tijd sterk toegenomen is. Mogelijk is vermindering van de arginase activiteit ook een goede behandelwijze voor aandoeningen waarbij sprake is van een verhoogde arginine afbraak door een toegenomen arginase activiteit (vierde doel, hoofdstuk 6). Om antwoord te krijgen op deze vraag hebben wij een muis ontwikkeld die arginase in bepaalde cellen van het lichaam mist. Deze muizen, Arg1 fl/fl /Tie2-Cre tg/- genaamd, kunnen geen arginase-1 meer maken in cellen die de binnenzijde van bloedvaten bekleden, de endotheelcellen, en in cellen die uit het beenmerg afkomstig zijn (bijvoorbeeld macrofagen). Door de afwezigheid van arginase-1 in deze cellen zal er mogelijk meer arginine beschikbaar zijn voor de NO productie. De afwezigheid van arginase-1 zorgde voor een hogere concentratie arginine in het bloed en een hogere NO productie, onder andere in de darm tijdens blootstelling aan endotoxinen. Helaas verbeterde de doorbloeding van het darmslijmvlies niet, waarschijnlijk doordat het NO door het verkeerde enzym gemaakt werd. Een ontstekingsreactie doet namelijk vooral de activiteit van het NOS2 enzym toenemen. Inderdaad bleken de macrofagen van muizen die geen arginase-1 enzym kunnen maken, meer NO te maken als ze blootgesteld werden aan LPS dan macrofagen van controle muizen. Door een specifieke blokkering van NOS2 (1400W) aan Arg1 fl/fl /Tie2-Cre tg/- muizen met een ontstekingsreactie toe te dienen, verminderde de NO productie inderdaad. Samenvattend hebben deze proeven laten zien dat de afwezigheid van arginase-1 leidt tot een heftiger ontsteking als gevolg van een toegenomen NO productie door NOS2. Wij vermoeden dat dit toegenomen arginine verbruik leidt tot een verminderde NOS3-afhankelijke vaatverwijding. Om deze reden dient arginase activiteit niet geremd te worden in patienten met een ontsteking.

Rol van het endotheel

Het vijfde doel van dit proefschrift was de gevolgen van een verminderde NO productie op de doorstroming van de microcirculatie in de darm te onderzoeken. Uit de resultaten van hoofdstuk 7 blijkt dat een tekort aan arginine tijdens blootstelling aan endotoxinen, leidt tot een afname van de NO productie en een verminderde doorbloeding van de darm. Omdat de arginine concentraties in het bloed van patiënten met een bloedvergiftiging verlaagd zijn en de NO productie verminderd is, is het herstellen van de beschikbaarheid van arginine voor een verbeterde doorstroming van de organen een belangrijk therapeutisch doel. Aangezien arginine uit het aminozuur citrulline gemaakt wordt door het enzym ASS en dit enzym ook aanwezig is in de endotheelcellen, zou toediening van citrulline aan patienten met bloedvergiftiging mogelijk kunnen leiden tot verbetering van de doorstroming van de microcirculatie (zesde doel). In hoofdstuk 7 hebben wij de toediening van citrulline vergeleken met die van arginine of alanine (een aminozuur waar geen NO uit gemaakt kan worden). Toediening van citrulline verhoogde niet alleen de plasma- en weefselconcentraties van arginine en citrulline, maar herstelde ook de NO productie in de darmen. Tevens zorgde alleen citrulline voor een verbeterde doorbloeding in het darmslijmvlies, terwijl arginine toediening geen verbeterde doorbloeding opleverde. Uit de resultaten van deze studie valt af te leiden dat citrulline een veelbelovend geneesmiddel voor patienten met een bloedvergiftiging is. Het volgende doel van dit proefschrift was te onderzoeken welke rol NO productie in de endotheelcellen van de bloedvaten speelt bij de doorstroming van microcirculatie in het slijmvlies van de darm (zevende doel). Aangezien de positieve effecten van citrulline toediening op NO productie in patienten met bloedvergiftiging afhankelijk zijn van de omzetting van citrulline in arginine door het enzym ASS, hebben wij de rol van dit enzym tijdens blootstelling aan endotoxinen onderzocht (achtste doel; hoofdstuk 8). Voor het beantwoorden van de zevende en achtste doelstelling hebben wij een muis ontwikkeld die het ASS enzym mist in de endotheelcellen en de cellen afkomstig uit het beenmerg (Ass fl/fl /Tie2-Cre tg/- muizen). Deze muizen hadden, net zoals muizen zonder arginase in dezelfde cellen, een hogere arginine concentratie in bloed en weefsels dan de controle groep. Deze hogere arginine concentraties leiden echter niet tot een toename van de NO productie of verbetering van de doorstroming van het darmslijmvlies. Deze resultaten laten zien dat de aanmaak van arginine in de endotheelcellen noodzakelijk is voor het gunstige effect van citrulline toediening bij ontstekingsreacties. Deze conclusie wordt ondersteund door onze waarnemingen in muizen die het NOS3 enzym missen (dit is verantwoordelijk voor de NO productie in de endotheelcellen die leidt tot vaatverwijding) en geen toename in de doorbloeding hebben. Net als Ass fl/fl /Tie2-Cre tg/- muizen hebben ook deze muizen een verminderde doorbloeding van het darmslijmvlies. Voorts hebben macrofagen zonder ASS een verminderde ontstekingsreactie vergeleken met macrofagen van controle dieren. Samenvattend kunnen wij concluderen dat bij een langdurig heftige ontstekingsreactie of bloedvergiftiging niet alleen de beschikbaarheid van substraat, maar ook de functie van de enzymen zelf behouden dient te worden om voldoende NO aan te kunnen maken en de doorbloeding van de darm op peil te kunnen houden. Als laatste experiment hebben wij in hoofdstuk 9 (negende doel) van dit proefschrift dan ook de rol van de NO producerende enzymen op de NO productie tijdens een bloedvergiftiging nagegaan. Voor dit onderzoek hebben wij gebruik gemaakt van knock-out muizen, d.w.z. van muizen die het Nos2 (Nos2-/-), Nos3 (Nos3-/-), of beide genen (Nos2-/-/Nos3-/-) niet meer hebben. In Nos3-/- en Nos2-/-/Nos3-/- muizen waren de negatieve effecten van blootstelling aan endotoxinen op de doorbloeding afwezig. Ondanks aanzienlijk hogere arginine bloedspiegels in deze muizen, bleven de gunstige effecten van citrulline toediening op de doorbloeding van het darmslijmvlies uit. Deze gegevens tonen aan dat alleen de NO productie door NOS3 de doorbloeding van het darmslijmvlies beinvloedt.

Van muis tot mens

Op grond van de gunstige effecten van L-citrulline toediening tijdens onze experimentele studies, werd als volgende stap het effect van L-citrulline toediening in de mens getest (tiende doel). Voordat het effect van citrulline op de arginine en NO productie en de slijmvliesdoorbloeding in ernstig zieke patienten met sepsis getest kon worden, diende het effect eerst in gezonde proefpersonen te worden aangetoond. Voor het onderzoeken van het effect van citrulline op ontstekingsreacties onderzochten wij een door duursport geïnduceerd ontstekingsmodel in de darm. Dit model werd gekenmerkt door een verminderde doorbloeding van de darm en een toegenomen ontstekingsreactie in de darm en kan leiden tot een verhoogde doorlaatbaarheid van de darmwand voor bacteriën. In hoofdstuk 10 tonen we aan dat citrulline toediening als een drankje, zowel de bloedspiegels van citrulline en arginine als de beschikbaarheid van arginine voor NO vorming verbetert ten opzichte van een placebo (nep) behandeling. Bovendien werd minder darmschade waargenomen. Ook verhoogde citrulline de doorbloeding van haarvaten onder de tong. Deze resultaten suggereren dan ook dat er sprake zou kunnen zijn van een verbeterde darmdoorbloeding. Als volgende stap, na het afronden van mijn proefschrift, zouden we citrulline willen toedienen aan ernstig zieke patiënten met een bloedvergiftiging om vast te stellen of deze ingreep ook leidt tot een verbetering van de doorbloeding in intensive-care patiënten en geen bijkomende nadelige effecten op de bloedsomloop heeft. Momenteel voeren wij de testfase van dit onderzoek uit. De eerste resultaten lijken veelbelovend.

Algemene conclusie

In dit proefschrift tonen we aan dat een te lage argininespiegel en te geringe NO productie in mensen en dieren met langdurige ontstekingsreacties of een bloedvergiftiging een nadelig effect heeft op de doorstroming van de microcirculatie. In dit proefschrift ontwikkelden wij een diermodel dat langdurig aan endotoxinen, de ziekmakende stof bij een bloedvergiftiging, werd blootgesteld en dat, net als de mens in een vergelijkbare situatie, een tekort aan arginine ontwikkelt. Het tekort aan arginine leidde in ons model tot een verminderde NO productie en doorbloeding van het slijmvlies van de darm. Toediening van extra citrulline zorgde ervoor dat de NO productie en de doorbloeding zich herstelden ondanks de ontstekingsreactie, terwijl dat niet gebeurde tijdens toediening van arginine. Verder toonde ons model aan dat de balans tussen het arginine verbruik (via arginase-1 en NOS2) en productie (via ASS) gehandhaafd moet blijven om de beschikbaarheid van arginine in stand te houden tijdens langdurige ontstekingsreacties. Op dit moment lijkt het erop dat het behoud of verbeteren van de functie van ASS en NOS3 tijdens een bloedvergiftiging de sleutel is van een succesvolle aanpak om het tekort aan arginine en de gebrekkige doorstroming van de darm door citrulline toediening te herstellen.

Valorization

In the following paragraphs we will describe the value of our work for society and the economy. Furthermore, we will highlight which target population will benefit from our newly developed model and therapeutic strategy. Finally we will shortly describe the innovation of our model and the utilization of our knowledge.

Social and economic value of the current thesis
Sepsis is a major health problem, which is associated with high rates of morbidity and mortality. The reported incidence varies between 75 to 300 per 100,000 patients worldwide, with mortality rates of approximately 25%. However, if complicated by multiple organ failure due to an impaired microcirculation, the mortality rates double. This results in high socio-economic costs. As described in chapter 2 of this thesis, an imbalance in NO production by NOS3 and NOS2 is hypothesized to play a key role in the development of multiple organ failure during sepsis and inflammatory conditions. Therefore, restoring NO production from arginine by the proper cells and enzymes in these conditions has been the subject of numerous studies over the past decades. Thus far, there is no definite treatment, so that the search for good therapeutic interventions is still ongoing. Previous nutritional interventions focussed on arginine supplementation, but the outcomes of these treatments differed widely, with either increased, unchanged, or decreased morbidity and mortality. The disparate outcomes of the human studies appear to result from the experimental animal models used to simulate and treat sepsis. Thus far, the acute sepsis model, which takes only a few hours, is usually used, but this model does not cause arginine deficiency. Therefore, the first goal of the current thesis was the development of an experimental model that mimics the human arginine-deficient state during endotoxemia. As described in detail in Chapter 4, we developed a mouse model with an 18h infusion of endotoxin that causes a decreased arginine availability and a diminished NO production and decreased microcirculation in jejunal tissue as found in septic human patients. Since our model mimics the human situation better with respect to the functional arginine deficiency than previously used models, new interventions tested in this model may be better suitable to have outcomes that better predict efficacy in humans than the previously used acute models. To develop a new therapeutic approach for sepsis, we first investigated whether arginine would be a suitable substrate in our model. As hypothesized, the results of our study show that arginine supplementation did not restore arginine availability and microcirculation during endotoxemia. Therefore, we conclude that arginine is not a suitable substrate for the treatment of these disturbances in NO production. In this thesis we further showed that L-citrulline supplementation is a good therapeutic strategy to restore the arginine availability in the cells of the jejunum during experimental endotoxemia. L-citrulline supplementation even resulted in an improved microcirculation and maintenance of the gastro-intestinal barrier in healthy athletes. Based on these beneficial results of L-citrulline supplementation, the findings during our study are potentially of high social and economic value for the medical society and the world of sports.

Target population
The results of this thesis are of interest to several target groups within the research field and health care. At first, the results presented in this thesis provide new insights for the development of specific nutritional supplements for patients with a disturbed arginine metabolism, such as septic patients. Therefore, the data of this thesis may be of special interest to pharmaceutical companies to develop new nutritional formulas for clinical usage in patients with disturbances in arginine metabolism. In line, these results are important for health care workers in the field of intensive care medicine, which deal with these septic patients daily. However, this arginine deficiency is not only present in inflammatory conditions, but is also present in abnormal fracture healing, disturbed wound healing and cardiovascular diseases. Therefore, the results of this thesis will be of interest to a much broader audience, including surgeons, cardiologists, and investigators in the biomedical field with special interest in endothelial dysfunction and microcirculation. Also, athletes and investigators in the field of sport medicine are likely to be interested, based on the beneficial results of L-citrulline supplementation during strenuous exercise.

Knowledge utilization
The knowledge obtained from our research in the area of nutritional supplementation in patients with arginine deficiency will be valorized through its application in future studies focused on improved metabolism during inflammatory conditions. The knowledge received from this thesis can already be incorporated in the current standard treatment of critical ill patients, focusing on enhancement of the microcirculation. Furthermore, as already mentioned in the previous paragraph the insights from our studies will help to develop nutritional strategies targeting the endothelial function in several different pathophysiological states. This eventually will lead to less social economic cost based on decreased hospitalization and diminished morbidity and mortality.

Innovation
The search for a good therapeutic strategy to maintain a functional microcirculation during sepsis and endotoxemia has been the subject of many different studies over the past decades. However, experimental studies used acute sepsis models, which are not a reliable model to study the human situation. In this regard, the present thesis exhibits various novel findings and insights. First, the experimental model described in this thesis is the first model, which uses a prolonged endotoxemia to test the therapeutic strategies targeting the arginine availability and metabolism. Furthermore, our results are the first to show that citrulline is a suitable substrate to improve arginine availability and microcirculatory function during inflammatory conditions, and, therefore, may be a promising new therapeutic strategy in patients. The novelty of the model and therapeutic approach has not gone unnoticed, as we were awarded the International Sepsis Forum award of the European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) in 2010 for the best new research on therapeutic interventions in the treatment of human sepsis. These studies will serve as basis for future studies that address arginine and NO deficiencies in human patients, especially in the (critically) ill.