Kartika Pertiwi

Atherotrombotische ziekten zoals coronaire hartziekten (acuut myocard infarct / AMI), veel vormen van cerebrovasculair accident (CVA, beroerte) en perifeer arterieel vaatlijden dragen in belangrijke mate bij aan wereldwijde mortaliteit en morbiditeit [1,2]. Het is algemeen bekend dat ontstekingen een zeer belangrijke rol spelen bij zowel het ontstaan van atherosclerotische plaques in bloedvaten als de daarop gesuperponeerde trombose. In dit proefschrift is de rol van twee relatief nieuwe aspecten van de ‘aangeboren immuniteit’ (innate immunity) in het complexe proces van atherosclerotische en trombotische ontsteking bestudeerd. Op de eerste plaats hebben we de rol van zogenaamde ‘extracellular traps’ en de daarmee samenhangende vorm van celdood (etose) bestudeerd in de progressie van atherotrombose en in de vaatwandhematomen die ontstaan na acute mediadissectie van de aorta. Op de tweede plaats hebben we de aanwezigheid van innate lymphoid cells (ILCs) bestudeerd in opeenvolgende stadia van atherosclerotische plaque ontwikkeling. Tenslotte onderzochten wij de klinische pathologische correlatie tussen histopathologische kenmerken van coronaire trombose, zoals ouderdom van de trombus, en verschillende klinische parameters van hartinfarctpatiënten. Dit laatste laat zien hoe basaal histologisch onderzoek kan bijdragen tot meer inzicht in het klachtenpatroon van patiënten.

Extracellular Traps bij atherotrombose en aortadissectie
Extracellular traps (ETs) zijn voor het eerst beschreven als dunne uitlopers van neutrofiele granulocyten, waarmee zij bacteriën kunnen vangen en doden [3]. ETs bestaan uit chromatinevezels (DNA en histonen) met daaraan bioactieve peptiden gebonden, die afkomstig zijn uit de granulen en het cytoplasma van de cel, zoals bijvoorbeeld neutrofiel elastase, myeloperoxidase, defensinen en cathelicidinen [4,5]. Het uitscheiden van ETs door neutrofielen gaat vaak gepaard met een nieuwe vorm van celdood die bekend staat als suïcidale etose (suicidal etosis) [6]. Het is bekend dat etose niet alleen belangrijk is voor de afweer bij infectieziekten, maar ook een belangrijke rol speelt bij andere ziekten van uiteenlopende aard, zoals trombose, auto-immuunziekten en kanker [5,8].

Het eerste deel van dit proefschrift laat zien dat deze ETs belangrijk zijn bij twee verschillende cardiovasculaire aandoeningen, namelijk coronaire atherotrombose en mediadissectie van de aorta. Hoofdstuk 2, evenals hoofdstuk 5 laten zien dat neutrofiele granulocyten en NETs in groten getale aanwezig zijn in arteriële aandoeningen die worden gecompliceerd door trombose en/of bloeding (gescheurde of geërodeerde coronaire plaques, plaques met intraplaque bloedingen en mediadissectie van de aorta). Echter, wanneer de arteriële wand intact blijft, zoals bij stabiele atherosclerotische plaques en verwijde aorta’s zonder dissectie, zijn deze NETs niet of nauwelijks aantoonbaar. Kennelijk zijn NETs alleen belangrijk tijdens de trombotische of hemorragische fase van deze aandoeningen. Wat betreft de atherosclerotische plaque met trombotische complicaties, lijken deze resultaten niet geheel overeen te komen met recente experimentele studies in muizen, die aantonen dat neutrofielen en NETs op verschillende manieren wel degelijk een rol zouden spelen bij de atherogenese. Zo is aangetoond dat NETs direct endotheel dysfunctie kunnen veroorzaken, wat beschouwd wordt als één van de eerste veranderingen aan de vaatwand bij het ontstaan van een atherosclerotische plaque [9]. Cholesterolkristallen kunnen in proefdieren de vorming van NETs bevorderen, waarna NETs op hun beurt weer Th17-cellen en IL-1β-secretie door macrofagen induceren (allemaal processen die bekend staan als ‘pro-atherogeen’) [10]. Verder is gebleken dat het remmen van PAD4, het enzym dat nodig is voor de vorming van NETs, zorgt voor het ontstaan van kleinere atherosclerotische plaques in muizen [11]. De verschillen tussen deze studies in muizen en onze resultaten laten nogmaals zien dat er verschillen zijn in de pathogenese van atherosclerose bij mensen en bij muizen. Of dergelijke processen, zoals die zijn waargenomen bij muizen, ook werkelijk voorkomen bij menselijke atherosclerotische plaques moet vooralsnog worden aangetoond. Een voordeel van onze studieopzet is het gebruik van menselijke plaques en trombus fragmenten. Deze opzet maakt het mogelijk de progressie van atherosclerose naar klinisch significante laesies, zoals plaque-erosies en intraplaque bloedingen in situ te bestuderen. Dit laatste is moeilijk, zo niet onmogelijk, na te bootsen in proefdiermodellen met muizen. De andere kant van dit verhaal is echter, dat het met menselijke vaatfragmenten ook heel lastig is om in detail de eerste veranderingen in de vaatwand, die uiteindelijk leiden tot het ontstaan van atherosclerotische plaque, te bestuderen. Of neutrofielen en NETs juist in deze eerste fase van plaqueontwikkeling wel degelijk een belangrijke rol spelen, kan aan de hand van onze resultaten dus ook niet worden uitgesloten.

In onze eerste studie (hoofdstuk 2) vonden wij dat de gebruikte immunohistochemische kleuring voor het aantonen van ETs niet alleen NETs aankleurt, maar ook ETs die zijn geproduceerd door andere celtypen. Dit duidt erop dat ook andere cellen ETs produceren. Nader onderzoek wees vervolgens uit dat dit inderdaad het geval was: macrofaag-, mestcel- en eosinofielen-ETs (respectievelijk METs, MCETs en EETs) konden worden aangetoond in zowel de menselijke coronaire atherosclerotische plaques als in coronaire trombi (hoofdstuk 3). NETs bleken echter wel het meest voorkomende type ET te zijn, gevolgd door METs, die ook in relatief grote hoeveelheden aanwezig bleken te zijn. Bovendien bleken METs in intacte atherosclerotische plaques en georganiseerde trombi vaker voor te komen dan NETs. Hierbij moet echter wel worden aangetekend dat in deze intacte plaques het totale aantal aanwezige ETs relatief laag was. Deze resultaten laten zien dat in de verschillende opeenvolgende stadia van progressie van trombose, verschillende celtypes NETs vormen en, naar kan worden aangenomen, daaraan gerelateerde biologische activiteit in de trombus.

Het uitscheiden van ETs is een vorm van celdood die ook bekend staat als etose. Van een andere vorm van celdood, apoptose, was al bekend dat het optreden ervan geassocieerd is met oudere leeftijd van een trombus en als zodanig zou kunnen dienen als een biomarker voor trombus-instabiliteit [12]. Omdat apoptose en etose nooit eerder tegelijkertijd in dezelfde weefsels zijn bestudeerd, hebben we deze twee vormen van celdood onderzocht in relatie tot de leeftijd van de coronaire trombi van infarctpatiënten. Naast het verlies van cellen door celdood, hebben we ook de vorming van nieuw weefsel gekwantificeerd door in deze preparaten ook de cel proliferatie te meten (hoofdstuk 4). We toonden aan dat aanwezigheid van etose, en niet apoptose of cel proliferatie, in coronaire trombi de meest constante factor is na het ontstaan van een hartinfarct [13]. Ook zagen we dat verse en lytische trombi meer etose vertoonden dan de georganiseerde, in welk stadium juist prolifererende gladde spiercellen en endotheelcellen vaker voor leken te komen [7]. Daarnaast vonden we, dat in vroege stadia de neutrofiele granulocyt het meest frequent etose ondergaat, terwijl later, naarmate de trombus veroudert en reorganiseert, dit juist de macrofaag is.

NETs zijn structuren die de vorming van trombose bevorderen en vormen een soort matrijs waaraan bloedplaatjes en erytrocyten zich kunnen hechten. Dit leidt tot groei van de trombus met grote kans op verder vernauwen van het vaatlumen. Daarnaast bevorderen NETs de stollingsactiviteit door het stimuleren van de intrinsieke en extrinsieke stollingsroutes. Samen met Tissue Factor (TF), bevorderen NETs de fibrinevorming en dus de stabilisatie van vers gevormd trombusweefsel [14,15]. Echter, NETs kunnen ook proteolytische enzymen bevatten en de activiteit van deze enzymen zou in de trombus kunnen leiden tot weefselafbraak of zelfs embolisatie. Dit zou mede kunnen verklaren waarom uit onderzoek bleek dat lytische trombi, waarvan bekend is dat deze naast veel NETs [16] ook veel proteolytische enzymen (zoals matrix metalloproteinasen) bevatten [17], een significant verhoogde mortaliteit lieten zien in de lange termijn follow-up van patiënten met doorgemaakt hartinfarct [18-20]. NETs zouden dus zowel trombus-stabiliserende als destabiliserende eigenschappen kunnen hebben. Echter, het is op dit moment nog niet duidelijk welke van de twee op welk moment overheerst en of dit bijvoorbeeld afhankelijk is van de ouderdom van de trombus in het bloedvat.

Immunohistochemie (IHC) in het algemeen en de identificatie van neutrofielen en NETs in het bijzonder, kunnen niet alleen bijdragen tot het bepalen van de leeftijd van een trombus (hoofdstuk 3 en 4), maar kunnen ook bij het bepalen van de ouderdom van een hematoom ten gevolge van een aortadissectie bijdragen. In hoofdstuk 5, bestudeerden we de aanwezigheid van neutrofielen en NETs, tezamen met T-cellen, macrofagen, endotheelcellen en gladde spiercellen, in preparaten met aortadissectie. Deze waren eerder, aan de hand van een hematoxyline en eosine (HE) kleuring geclassificeerd als acuut, subacuut, vroeg organiserend of verlittekend (zeer oud). Deze studie toonde aan dat het bepalen van de leeftijd van het hematoom met een HE-kleuring in combinatie met IHC een grotere betrouwbaarheid geeft dan een diagnose op basis van alleen de HE-kleuring. Subtiele kenmerken van trombusorganisatie, zoals de ingroei van gladde spier- of endotheelcellen zijn niet altijd duidelijk in een HE-kleuring. Neutrofielen en NETs bleken ook een trombus-leeftijd afhankelijk distributiepatroon te hebben. In het stolsel nam hun aantal aanzienlijk toe in de subacute fase, gevolgd door een daling in de organiserende en latere verlittekenende stadia. Vanwege de stolling bevorderende eigenschappen van NETs, zou het verschuiven van het hemostatisch evenwicht naar bloedstolling een gunstig effect kunnen hebben op de reparatie van het dissectie kanaal in de aortamedia. Het zou bovendien een eventuele verdere breuk van de aortawand, die kan leiden tot massale bloeding, kunnen voorkomen.

Een heel interessante bevinding van deze studie was, dat het patroon van toename gevolgd door een afname van het aantal neutrofielen en NETs, zoals we zagen in het haematoom in relatie tot ouderdom, ook werd gezien in de adventitia en het perivasculaire vet van de aorta dissecties. Een dergelijke ontstekingsreactie met neutrofielen en NETs werd namelijk óók gezien in de (peri)adventitia van kransslagaders na trombotische complicaties van een atherosclerotische plaque (hoofdstuk 2). De pathologische betekenis van deze reactie is niet duidelijk, maar het kan zijn dat deze immuunrespons op de één of andere manier het reparatieproces in de arterie bevordert. De vorming van secundaire lymfoïde structuren in de adventitia (VALT) is een bekend fenomeen bij atherosclerose en het kan zijn dat de aanwezigheid van neutrofielen en NETs in de adventitia, zoals we hier zagen, hiervan het eerste stadium is.

Innate lymphoid cells en atherosclerose
Innate lymphoid cells (ILCs) zijn een relatief recent ontdekte familie van ontstekingscellen, waarvan wordt aangenomen dat ze een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van veel immuun-gerelateerde ziekten [21]. ILCs worden beschouwd als de tegenhanger van de adaptieve T-helpercellen, maar maken deel uit van het aangeboren immuunsysteem [22]. Van ILCs wordt verondersteld dat zij vooral belangrijk zijn in de vroege ontwikkelingsstadia van ziekten. ILCs brengen geen antigeen receptoren tot expressie, maar in plaats daarvan reageren ze op specifieke cytokinen die in hun micro-omgeving worden geproduceerd [23,24]. Recente studies bij muizen lieten zien dat ILCs mogelijk een rol spelen bij atherosclerose [25,26], maar tot op heden is er in de literatuur niets bekend over de eventuele aanwezigheid van ILCs in humane atherosclerotische plaques. Het aantonen van ILCs in menselijk weefsel in situ is lastig, omdat er geen unieke (cel specifieke) markers zijn om ILCs specifiek te aan te kleuren, zodat er altijd een combinatie van meerdere antilichamen tegelijkertijd nodig is om hun identiteit te bevestigen. Onlangs heeft ons lab een immunohistochemische quadrupel-kleuring ontwikkeld om ILCs te aan te kleuren die kan worden toegepast op formaline gefixeerd, paraffine ingebed weefsel [27]. Deze kleurmethode werd in dit proefschrift gebruikt om de aanwezigheid van ILCs te onderzoeken in verschillende ontwikkelingsstadia van menselijke atherosclerotische plaque vorming, namelijk in vroege, gevorderde (uitgerijpte) en door atherotrombose gecompliceerde plaques. Vervolgens zijn deze cellen gekwantificeerd als absolute aantallen, maar ook als percentage van het totaal aan lymfoïde cellen dat aanwezig is in de plaques. In hoofdstuk 6 is de identificatie van de drie ILC-subtypen in humane atherosclerotische plaques beschreven, namelijk ILC1s (tegenhangers van Th1-cellen), ILC2s (Th2 tegenhangers) en ILC3s (Th17 tegenhangers). ILC1 bleek de meest voorkomende subset in alle stadia te zijn, gevolgd door ILC2 en ILC3. Uitgedrukt als absolute aantallen, namen hun aantallen in gevorderde en gecompliceerde plaques weliswaar toe, maar als percentages van de totale lymfoïde populatie leek hun aantal in die stadia juist af te nemen. De T-lymfocyten-subsets kwamen in de bestudeerde plaques bijna altijd vaker voor dan hun ILC-tegenhangers, alleen ILC1 in de zeer vroege fase van plaque vorming vormde hierop een uitzondering. In vroege laesies leken er zelfs meer ILC1s aanwezig, maar dit verschil bleek statistisch echter niet significant. Toch is het interessant te vermelden dat in 3 vroege laesies die we bestudeerd hadden alle daarin aanwezige lymfoïde cellen ILC1s bleken te zijn en er geen conventionele lymfocyten aanwezig waren. Dit suggereert dat ILC1s vooral vroeg in de ontwikkeling van atherosclerotische van belang zijn, een hypothese die wordt ondersteund door een recente studie met gebruik van een experimenteel muismodel van atherosclerose, waarin naar voren kwam dat de ILC1 subpopulatie de vorming van atherosclerotische plaques verergert [28]. Bovendien passen deze waarnemingen ook in het huidige concept dat ILCs vooral belangrijk in het begin van een ontstekingsproces. In onze studies vonden wij daarentegen ook ILCs in de latere stadia van atherosclerotische plaque vorming, zodat het erop lijkt dat zij ook bijdragen aan de ontstekingsreacties in de gevorderde plaques en gecompliceerde laesies. Er is meer onderzoek nodig om de functionele betekenis van de verschillende soorten ILCs tijdens atherogenese volledig te begrijpen en daarmee te evalueren of deze cellen mogelijk een aangrijpingspunt kunnen zijn in de preventie van atherosclerotisch plaque vorming bij de mens.

Acute trombotische occlusies kunnen leiden tot levensbedreigende ziekten, niet alleen in het hart, maar ook in de hersenen. In het laatste deel van dit proefschrift hebben we klinisch-pathologische correlaties onderzocht bij patiënten met kransslagaderaandoeningen en met cerebrovasculaire aandoeningen, en die daarvoor een trombectomie ondergingen als onderdeel van hun behandeling. Hoofdstuk 7 presenteert een retrospectief onderzoek naar de histopathologische bevindingen in de trombusaspiraten van patiënten met een vaatocclusie-gerelateerde beroerte van een groot vat (large vessel occlusion related stroke, LVOS, n = 75) en patiënten met ST-segment elevatie myocardinfarct (STEMI, n = 51) in relatie tot verschillende klinische kenmerken en prognostische uitkomst. De oorzaken van LVOS werden onderverdeeld in grote arteriële atherosclerose (LAA), cardio-embolie (CE), small vessel disease of embolische beroerte van onbekende bron (embolic stroke of unknown source, ESUS). Net als bij onze eerdere studies, werd de trombus-leeftijd geclassificeerd als zijnde vers, lytisch of georganiseerd. We vonden dat de trombus leeftijdsverdelingen van LVOS versus die van STEMI-patiënten significant van elkaar verschilden. In beide groepen werden verse trombi het vaakst gevonden, maar oudere trombus bleek significant vaker voor te komen bij patiënten met LVOS (47%) dan bij STEMI-patiënten (38%). Er werden echter ook verschillen gevonden binnen het diverse LVOS-cohort: LAA-patiënten bleken een vergelijkbare trombusleeftijdopbouw te vertonen als STEMI-patiënten (beide locaties worden beschouwd als large vessel disease). Onze bevindingen verschillen wel van andere histopathologische trombusstudies in LVOS, wat eens te meer laat zien dat er behoorlijk veel variatie is wat betreft de samenstelling van de trombus en verschillen in de onderliggende pathofysiologie van patiënten met CVA [28,29]. Zo werden oude trombi bijvoorbeeld niet gevonden in gevallen met een cardio-embolische beroerte. Verder zagen we in deze studie dat oudere trombi geassocieerd waren met een hogere mortaliteit na 2 jaar follow-up. Dit laatste is vergelijkbaar met eerdere trombectomie studies bij patiënten met AMI, waarbij ook een hogere mortaliteit bij follow-up werd gevonden in de groep van patiënten met (histologisch) oudere trombi. In de huidige studie vonden we deze associatie met een slechtere prognose niet alleen in het cohort van STEMI-patiënten, maar ook in het cohort van patiënten met LVOS.

Slotopmerkingen
Dit proefschrift beschrijft een aantal studies naar de betrokkenheid van ETs en ILCs in atherotrombotische ziekten en ook naar ETs in aortadissecties. ETs in de trombi van patiënten met een hartinfarct of een beroerte zouden kunnen fungeren als potentiele weefsel-biomarker voor wat betreft de stabiliteit van de plaque en progressie van trombusvorming in de tijd, hetgeen klinisch van betekenis kan zijn. Meer onderzoek is nodig om de pathofysiologische betekenis van ETs in atherotrombose beter te begrijpen, maar het gebruik van deze biomarkers zou in de toekomst mogelijk kunnen bijdragen tot het vaststellen van een fase van instabiele (fragiele, en dus makkelijk emboliserende) trombus, het afstemmen van specifieke, op trombus of plaque compositie gebaseerde therapie en ook voor de risicostratificatie bij het inschatten van morbiditeit en mortaliteit op termijn voor patiënten met een hartinfarct of beroerte. De ILCs die wij aantoonden in plaques in verschillende stadia van ontwikkeling, zijn krachtige immunomodulerende cellen en als zodanig bieden zij potentieel eveneens therapeutische mogelijkheden om atherotrombose te behandelen of te voorkomen. In ieder geval blijkt dat de combinatie van histopathologisch en klinisch onderzoek weer nieuwe informatie aan het licht brengt omtrent de etiologie van atherosclerose en trombose.

RINGKASAN DAN PEMBAHASAN

Penyakit aterosklerosis dan trombosis seperti jantung koroner (infark miokard akut), iskemik otak (stroke), dan penyakit pembuluh darah arteri tepi masih menjadi penyebab utama kematian dan kesakitan global [1,2]. Menurut literatur terkini, inflamasi merupakan faktor yang berperan penting dalam perjalanan penyakit, baik aterosklerosis maupun trombosis, (selanjutnya disebut aterotrombosis). Tesis ini memaparkan keterlibatan dua aspek baru dalam proses inflamasi pada aterotrombosis. Pertama, tesis ini berfokus pada (1) peran jaring-jaring ekstraseluler (extracellular traps/ETs) dan kematian sel (etosis) dalam progresivitas aterotrombosis dan hematom pada diseksi (robekan) aorta; serta (2) peran potensial sel limfoid alami (innate lymphoid cells/ILCs) dalam patogenesis aterosklerosis.

Kedua, tesis ini dikembangkan untuk mempelajari keterkaitan antara penelitian histopatologi dengan penelitian klinis pasien. Implementasi hasil penelitian histopatologi dalam praktik klinis melalui temuan signifikan tesis ini diharapkan dapat membantu evaluasi penanganan pasien penyakit aterotrombosis seperti infark miokard akut dan stroke.

Peran jaring-jaring ekstraseluler (extracellular traps/ETs) pada aterotrombosis dan diseksi aorta
Jaring-jaring ekstraseluler (ETs) pertama kali dideskripsikan sebagai produk keluaran netrofil dalam menjerat dan membunuh patogen [3]. ETs merupakan serabut kromatin tipis (terdiri dari asam nukleat/DNA dan protein histon) yang dilapisi peptida granula dan sitoplasma neutrophil elastase, myeloperoxidase, dan cathepsin G [4,5]. Netrofil yang melepaskan ETs selanjutnya mengalami kematian dengan mekanisme khusus yang disebut sebagai etosis bunuh diri (suicidal etosis) [6]. Saat ini, etosis menjadi topik yang menarik dalam penelitian berbagai macam penyakit, bukan hanya penyakit infeksi melainkan juga penyakit lain seperti kardiovaskular, autoimun, dan kanker [5,7].

Tesis ini dibagi menjadi dua bagian. Bagian pertama tesis ini membahas peran penting ETs pada dua kondisi patologis, yaitu aterotrombosis arteri koroner dan diseksi lapisan tengah aorta. Seperti yang telah dijelaskan pada Bab 2 dan Bab 5, netrofil dan jaring-jaring ekstra selulernya (neutrophil extracellular traps)