Huala Wu

(CLEM) toonden echter aan dat de Pex3- en Inp1-bevattende pleisters zich bevinden in het gebied waar peroxisomen nauw aansluiten op het plasmamembraan (PM), wat aangeeft dat Inp1 en Pex3 waarschijnlijk een rol spelen in peroxisoom-PM-contactstypen (PerPMCS). Verwijdering van INP1 resulteerde in de afwezigheid van perifere Pex3-pleisters en had een significante invloed op de vorming van PerPMCS, maar niet op peroxisoom-ER-contacten. Bovendien breidde overproductie van Inp1 de contactplaatsen tussen peroxisomen en de PM uit. Al met al geven onze gegevens aan dat de perifere Pex3-patches, samen met Inp1, vereist zijn voor de vorming van PerPMCS.

Om extra eiwitten te identificeren die een rol spelen bij de vorming van Pex3-afhankelijke peroxisomale MCS’s, hebben we in vivo pull-down experimenten uitgevoerd om nieuwe eiwitten te identificeren die binden aan Pex3 (Hoofdstuk V). Pex3-complexen werden geanalyseerd met vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. 34 vermeende Pex3 interactie-eiwitten werden geïdentificeerd. Vier eiwitten, waaronder Atg30, Emc1, Tsc13 en Vps26, werden beschouwd als de meest veelbelovende kandidaten. De rol van autofagie-gerelateerd eiwit 30 (Atg30) en de ER-membraancomplexsubeenheid 1 (Emc1) werd verder onderzocht in hoofdstuk V.

In de gist P. pastoris is aangetoond dat het Pex3-bindende eiwit Atg30 werkt bij autofagische afbraak van peroxisomen (pexophagy) (Farré et al., 2008). Emc1 is geïmpliceerd om te functioneren in ER-mitochondrion-contactsites in S. cerevisiae (Lahiri et al., 2014). Om inzicht te krijgen in de rol van Atg30 en Emc1 in peroxisoombiologie, zijn fluorescentiemicroscopie-onderzoeken uitgevoerd om deze eiwitten te lokaliseren. Dit onthulde dat Atg30 co-lokaliseert met Pex3 op het peroxisomale membraan. Atg30-GFP-patches zijn echter niet gelokaliseerd op VAPCONS. Zoals verwacht, lokaliseerde Emc1 naar de ER en co-lokaliseerde af en toe met Pex3, mogelijk op peroxisome-ER-contactlocaties.

Atg30 is niet vereist voor VAPCONS-vorming, omdat deze MCS’s nog steeds werden gevormd in cellen van een ATG30-deletie-stam. Interessant is dat vergrote peroxisomen aanwezig waren in atg30-mutante cellen, hetgeen suggereert dat Atg30 kan functioneren in normale peroxisoombiogenese. De rol ervan bij de vorming van peroxisomen moet echter verder worden geanalyseerd.

In emc1-mutanten werd de vorming van VAPCONS vertraagd na een overdracht van cellen van glucose naar methanolmedium. Verwijdering van EMC1 had echter geen invloed op de grootte of het aantal peroxisomen, wat aangeeft dat dit eiwit niet essentieel is voor de normale vorming van peroxisomen.