Celine Koster

De ontwikkeling van experimentele therapieën voor degeneratieve netvliesziekten

Dit proefschrift beschrijft een deel van het preklinische onderzoek welke essentieel is voor het ontwikkelen van experimentele therapieën voor degeneratieve netvliesziekten, zoals leeftijd gerelateerde maculadegeneratie (LMD) en een specifiek type van retinitis pigmentosa (RP-RPE). Een laagje netvliescellen, het retinaal pigment epitheel (RPE), speelt een belangrijke rol in de pathologie van beide ziektes. Patiënten van alle leeftijden kunnen te maken krijgen met oogziektes waarbij (hoofdzakelijk) het RPE is aangedaan. In dit proefschrift staat de pathologie RPE-ziektes centraal. Dit wordt geïllustreerd door de complexe netvliesziekte LMD en een meer specifieke genetische variant van de monogene aandoening RP. Veel experimentele therapieën worden op dit moment ontwikkeld om LMD en RPE-RP te kunnen behandelen. Gentherapie en regeneratieve celtherapie kunnen worden gezien als veel belovende strategieën om deze ziektes te kunnen (gaan) behandelen. Dit komt doordat deze therapieën gericht zijn op genezing. De overige therapeutische strategieën zijn vooral gericht op het behandelen van symptomen.

In dit proefschrift hebben we allereerst, met een systematische aanpak, alle voorheen gepubliceerde preklinische studies op het gebied van regeneratieve RPE celtherapie voor degeneratieve netvliesziekten gelezen en geanalyseerd (Hoofdstuk 2). Ook hebben we, door middel van genetische modificatie, een nieuw diermodel voor een RPE-RP subtype gemaakt. Dit model hebben we uitgebreid gekarakteriseerd (Hoofdstuk 3). Vervolgens beschrijven we een geïnduceerd preklinisch model voor LMD en de uitgebreide karakterisatie van dit model (Hoofdstuk 4). Als een laatste stap in dit proefschrift beschrijven we een driedimensionaal (3D) weefsel dat gemaakt is met behulp van een bioprinter. Dit weefsel is een model voor het RPE en de onderliggende weefsels. Tenslotte hebben we dit weefsel getransplanteerd in een rattenoog en beschrijven we de integratie ervan (Hoofdstuk 5). Hieronder volgt een korte per hoofdstuk van dit proefschrift.

Hoofdstuk 1 bevat een korte introductie over degeneratieve netvliesziekten en de enorme impact die deze ziektes hebben op de kwaliteit van leven van patiënten. Ook staat de structuur en de functie van het gezonde netvlies beschreven. Het RPE is betrokken bij veel degeneratieve netvliesziekten. Dit kan makkelijk worden begrepen door te lezen over alle essentiële taken die het RPE heeft om normaal te kunnen zien. De pathologie en de etiologie van de ziektes LMD en RPE-RP worden beschreven en een aantal experimentele therapeutische strategieën worden kort genoemd. In Hoofdstuk 1 worden de beschikbare experimentele modellen en hun toepasbaarheid in onderzoek naar degeneratieve netvliesziekten beschreven. Zowel in vitro (in een kweekschaaltje) als in vivo (dier) modellen worden beschreven en samengevat. Er komen steeds meer (humane) representatieve in vitro modellen, zoals celkweken en netvlies organoïden, beschikbaar. Toch kunnen deze (nog) niet model staan voor een compleet oog of de mogelijkheid tot (therapeutisch in)zicht in de context van een levend organisme. Daarom zijn diermodellen die het fenotype van de ziekte representeren nog steeds noodzakelijk om te gebruiken. Alleen in vivo kan “het zien” worden getest en of de experimentele therapieën veilig en effectief zijn. Binnen de LMD en RPE-RP patiënten populaties bestaan er grote etiologische verschillen. Mede hierom zijn gepersonaliseerde behandelingsstrategieën ontzettend belangrijk voor deze patiënten en wordt er binnen het onderzoeksveld momenteel veel focus op gelegd. Een uitgebreide uiteenzetting van mogelijke (toekomstige) therapeutische strategieën kan worden gevonden in Hoofdstuk 6.

In Hoofdstuk 2 is een uiteenzetting te vinden van alle in de literatuur beschikbare preklinische studies over diermodellen en de transplantatie van het RPE als regeneratieve celtherapie. Het vervangen van de RPE cellaag in LMD en het RPE-RP subtype, voornamelijk in de vergevorderde stadia van deze ziektes, is de meest belovende experimentele therapeutische aanpak: met name als al een groot gedeelte van het zicht verloren is gegaan. Op het moment is er echter geen algemene overeenstemming over de optimale bron van de RPE cellen, de plaatsingsstrategie, of het beste diermodel om de RPE celtherapie te kunnen testen. Meerdere RPE cel bronnen, transplantatiestrategieën en diermodellen zijn inmiddels gebruikt in dit onderzoeksveld, met wisselende resultaten. Tot dusver was een systematische evaluatie van de efficiëntie van RPE celtherapie en de variabelen die dit beïnvloeden nog niet beschikbaar. In dit hoofdstuk hebben we het effect van RPE transplantatie op het zicht in diermodellen van degeneratieve netvliesziekten systematisch onderzocht en beschreven. Ook hebben we bekeken wat de impact is van de bron van de RPE cellen op de effectiviteit van de celtherapie evenals de plaatsingsstrategie en het diermodel dat werd gebruikt. Om dit te onderzoeken, hebben we systematisch alle publicaties betreffende RPE transplantaties in diermodellen geïdentificeerd. Meerdere studie eigenschappen zoals diersoort, geslacht, leeftijd van de dieren, maar ook celtype, het aantal cellen en andere eigenschappen van de interventie zijn van alle studies verzameld. Er is ook gekeken naar het risico op bias in de geïncludeerde studies: over het algemeen moesten de meeste studies in de categorie “onduidelijk” worden geplaatst. Dit werd vooral veroorzaakt doordat veel experimentele details niet of nauwelijks werden gerapporteerd. Meta-analyses zijn gedaan op de gemeten a- en b-wave amplitudes uit electroretinogrammen (ERG) en op gedragsstudies waar het zicht invloed op heeft. RPE transplantatie verbeterde significant de ERG a- en b-wave amplitudes en ook het visueel gebaseerde gedrag van de dieren. Een subgroep analyse liet zien dat een groter effect kon worden behaald als er jonge en jong-volwassen dieren werden gebruikt in vergelijking met volwassen dieren. Ook bleek dat het transplanteren van meer cellen (10^5 versus 10^4) een significant groter effect had in de gedragsstudies. De bron van de getransplanteerde cellen maakte ook zeker een verschil op de efficiëntie van de transplantatie. Een significant groter effect werd gevonden in de gedragsstudies als ARPE-19 cellen en OpRegen RPE cellen werden gebruikt. De conclusie van dit hoofdstuk is dat het transplanteren van RPE cellen in diermodellen voor netvliesdegeneratie veilig is en efficiënt kan zijn. Ondanks dat is er nog steeds een grote noodzaak om de kwaliteit van de methodologie en het rapporteren van experimentele opzet van dierproeven te verbeteren. Alleen dan kunnen zulke studies goed met elkaar worden vergeleken en kunnen vervolgstappen beter bepaald worden.

In Hoofdstuk 3 staat de ontwikkeling en karakterisatie van een nieuw diermodel voor een RPE-RP subtype (het LRAT-RP subtype) uitgebreid beschreven. De genetische mutatie die bij dit subtype betrokken is, erft autosomaal recessief over. Door middel van CRISPR/Cas9 werd een ratmodel gecreëerd (Lrat-/- ratten) dat een mutatie heeft in het gen voor het eiwit lecithine retinol acyltransferase (LRAT). De geïntroduceerde mutatie (c.12delA) is gebaseerd op een Nederlandse patiëntengroep die een homozygote frameshift mutatie hebben in het LRAT gen (c.12delC). Deze mutatie veroorzaakt een verstoorde en niet functionele visuele (retinoïde) cyclus. We hebben bevestigd dat de mutatie in het rattenmodel aanwezig is door middel van het sequensen van het DNA en RNA. Ook hebben we de mate van expressie van Lrat bepaald op zowel het RNA niveau als het eiwit niveau in wildtype en gemuteerde ratten door middel van RT-PCR en immuunhistochemie. Wildtype dieren hadden hoge expressie van Lrat mRNA in meerdere soorten weefsels, zoals het oog en de lever, maar Lrat-/- dieren hadden dit vrijwel niet. Het LRAT eiwit was in grote hoeveelheid aanwezig in wildtype dieren en niet aanwezig in Lrat-/- dieren. De structuur en functie van het netvlies van Lrat-/- en controle ratten werden gekarakteriseerd door middel van scanning laser oftalmoscopie (SLO), optische coherentie tomografie (OCT) en ERG. Het visueel gedrag van de dieren werd in kaart gebracht door middel van gedragsexperimenten. Na vier maanden was de dikte van de retina in Lrat-/- dieren afgenomen tot ongeveer 80 % in vergelijking met gezonde controles. Ook hadden Lrat-/- dieren progressief gereduceerde ERG potentialen vanaf de leeftijd van twee weken. De visuele gedragsexperimenten bevestigden dat de Lrat-/- ratten minder goed kunnen zien. Er was geen structureel of functioneel netvliesverschil tussen heterozygote en wildtype dieren. Dit was ook niet de verwachting op basis van de patiënten data. Dit gepigmenteerde rattenmodel is een nieuw model voor het LRAT-RP subtype en van vroeg optredende netvliesdystrofieën. Dit model heeft meerdere voordelen ten opzichte van bestaande muis- en ratmodellen en het kan gebruikt worden voor translationele en therapeutische studies van LRAT-RP.

In Hoofdstuk 4 wordt het genereren en karakteriseren van een geïnduceerd model voor LMD beschreven. Gepigmenteerde muizen en ratten werden systemisch geïnjecteerd met verschillende doses van natriumjodaat (NJ) zout. Van dit middel is bekend dat het netvliesdegeneratie veroorzaakt door middel van oxidatieve stress. Omdat oxidatieve stress in het RPE een belangrijke oorzaak is van de pathologie van LMD, kan dit geïnduceerde model LMD representeren in wetenschappelijk onderzoek. Na de injectie werden de netvliesstructuur en de visuele functie over een tijdsperiode niet-invasief gemeten. Op deze manier werd er gedetailleerde informatie verkregen over de geschiktheid van deze modellen om model te staan voor (droge) LMD en andere netvliesaandoeningen waarin het RPE een rol speelt. Verschillende doses zout (0 – 70 mg/kg) werden geïnjecteerd in de staartaders van jong-volwassen muizen en ratten (i.v.). De structuur en de functie van het netvlies werden niet-invasief beoordeeld door middel van SLO, OCT en ERG. We ontdekten dat de mate van netvliesdegeneratie na injectie vergelijkbaar was in de twee hiervoor genoemde diersoorten. De laagste dosis (10 mg/kg) veroorzaakte geen meetbaar structureel of functioneel effect. Een injectie van 20 mg/kg NJ resulteerde in een zeer minimale netvliesdegeneratie volgens de OCT beelden. Bij deze dosis namen de ERG amplitudes wel tijdelijk af, maar keerden ze binnen twee weken weer terug naar de uitgangswaarde. Injecties van de hogere doses (30, 40, 50 en 70 mg/kg) resulteerden in een matige tot ernstige structurele schade aan het RPE en aan het netvlies. Verminderde ERG amplitudes wijzen op een functioneel visuele afwijking bij zowel de muizen als de ratten. De conclusie van dit hoofdstuk is dat een systemische injectie met NJ een dosisafhankelijke structureel en functioneel pathologisch effect heeft op het RPE en het netvlies. Een dosis van 30 mg/kg lijkt een geschikte dosis voor toekomstig onderzoek naar de ontwikkeling van experimentele therapieën. Deze relatief gemakkelijk te induceren niet-erfelijke modellen kunnen erg nuttig zijn voor het evalueren van nieuwe therapieën voor RPE-gerelateerde ziekten van het netvlies, zoals LMD en het RPE-RP subtype.

In Hoofdstuk 5 wordt de constructie van een 3D weefsel beschreven dat de buitenste bloed-netvlies-barrière (bBNB) vertegenwoordigt. De bBNB bestaat uit het RPE en zijn cel-cel contacten (“tight junctions”). Het RPE wordt geflankeerd door de fotoreceptor cellaag aan de apicale zijde en het membraan van Bruch en de choriocapillaris aan de basale zijde. Er wordt gedacht dat in eerste instantie voornamelijk het RPE is aangetast bij LMD, gevolgd door de degeneratie van de aangrenzende weefsels. Het mechanisme van de initiatie en de progressie van LMD blijft nog niet volledig begrepen, vooral vanwege het ontbreken van fysiologisch relevante modellen voor de bBNB en flankerende weefsels. We hebben een 3D weefselmodel geconstructureerd voor de bBNB door middel van endotheelcellen, pericyten en fibroblasten aan de basale kant van een biologisch afbreekbare houder te bioprinten en er een RPE cellaag bovenop te plaatsen. In deze 3D-bBNB is een volledig gepolariseerde RPE cellaag met apicale processen, basale instulpingen en tight junctions te vinden met een relevante barrièreweerstand. Ook wordt in dit weefsel de organisatie en de specifieke genexpressie van het choroid in de choriocapillaris geïnduceerd. Verder ondersteunt het de vorming van een natuurlijk Bruch-achtig membraan dat de weefselintegratie in rattenogen mogelijk maakt. Activatie van het complementsysteem in het 3D-bBNB initieert droge LMD-achtige fenotypes (inclusief subRPE drusen en degeneratie van de choriocapillaris), en hypoxie-geïnduceerde natte LMD-achtige fenotypes (neovascularisatie van de choriocapillaris). Behandeling met anti-VEGF middelen onderdrukt deze neovascularisatie in 3D-bBNB weefsels. Het nieuwe 3D-bBNB weefsel bootst in essentie LMD fenotypen na, waardoor de ziektemechanismen nu beter begrepen kunnen worden. Een volledig syngeen 3D-bBNB weefsel dat gemaakt is uit stamcellen van LMD patiënten kan licht werpen op een meer uitgebreid begrip van de pathologie en het verloop van deze ziekte.

Hoofdstuk 6 gaat in op de momenteel gangbare experimentele therapeutische strategieën voor degeneratieve netvliesziekten en, meer specifiek, voor LMD en het RPE-RP subtype. Hoewel er veel wetenschappelijke inspanning gestoken is in translationeel onderzoek om nieuwe experimentele therapieën voor degeneratieve netvliesaandoeningen te ontwikkelen, valt er nog veel te leren. Het ontbreekt ons op dit moment aan systematische data en gedetailleerde informatie over de (nieuw ontwikkelde) preklinische modellen en het therapeutisch potentieel van experimentele therapieën. Hoewel er momenteel verschillende klinische onderzoeken lopen in verschillende fasen, zijn de resultaten tot nu toe om verschillende redenen vaak variabel en inconsistent. Om de reproduceerbaarheid en consistentie te garanderen, zijn betere, meer gestandaardiseerde en systematische protocollen essentieel voor zowel het preklinische als het klinische onderzoek.

The work of today is the history of tomorrow,
and we are its makers.
— Juliette Gordon Low