Suzanne Van Helden

Het immuunsysteem speelt een essentiële rol in de bescherming tegen infecties. Misregulatie van het immuunsysteem kan leiden tot aanhoudende infecties, kanker, auto-immuunziekten en allergie. Het aangeboren immuunsysteem is een evolutionair geconserveerd systeem dat pathogenen herkent en opruimt. Een tweede verdedigingslijn wordt gevormd door het adaptieve immuunsysteem, dat geactiveerd wordt door antigen presenterende cellen (APCs) van het aangeboren immuunsysteem; dendritische cellen (DCs), macrofagen en monocyten. DCs zijn de sterkste APCs als het gaat om het activeren van T-cellen. Tijdens hun leven doorlopen DCs meerdere fasen waarin ze verschillende functies uitoefenen. DC-voorlopercellen verplaatsen zich van het bloed naar de weefsels, waar de onvolwassen DCs (iDCs) patrouilleren op zoek naar antigenen. Na interactie met zulke antigenen ondergaan de DCs een maturatieproces waardoor iDCs veranderen in volwassen DCs (mDCs) die migreren naar de lymfeknopen waar de T-cellen geactiveerd worden. Deze migratie vanuit de weefsels naar de lymfeknopen is van groot belang voor het induceren van een productieve immuunrespons. In dit proefschrift is de regulatie van adhesieve en migratoire eigenschappen tijdens DC-maturatie onderzocht. Het onderzoek naar de biologie van DCs wordt bemoeilijkt door een aantal factoren. DCs zijn primaire cellen die moeten worden geïsoleerd uit het bloed of de milt. Een alternatief hiervoor is het isoleren van voorlopercellen, zoals CD14+ cellen of monocyten, om die vervolgens te differentiëren tot DCs. Voor deze methode is het gebruik van dure cytokinen vereist. Het aantal cellen dat op deze manier verkregen kan worden is beperkt, net als het tijdsbestek waarin deze kweken gebruikt kunnen worden. Verder is het (genetisch) manipuleren van (voorlopers van) DCs erg moeilijk. Extra complicaties ontstaan door verschillen tussen donoren. Om de complexe biologie van DCs beter te kunnen bestuderen zou een goede model DC-cellijn erg nuttig zijn. Daarom hebben wij verschillende muizen- en humane cellijnen vergeleken voor het gebruik als model DC-cellijn (hoofdstuk 2). Voor de muis is de D1-cellijn degene die de meeste overeenkomsten met DCs vertoont. Deze cellijn is evenwel moeilijk (genetisch) te manipuleren en groeit langzaam. De (macrofaagachtige) Raw264.7 cellijn is een goed alternatief wanneer celmanipulatie of grote aantallen nodig zijn. Van de humane cellijnen lijkt op dit moment de MUTZ-3 cellijn het beste model om de biologie van (vooral volwassen) DCs te bestuderen. Helaas zijn ook deze cellen moeilijk genetisch te manipuleren en moeten deze onder strikt gecontroleerde omstandigheden gekweekt worden. Verder hechten deze cellen relatief slecht waardoor ze minder geschikt zijn voor studies naar DC-adhesie. Voor dit laatste vormen de THP-1 of HL-60 cellen een goed alternatief. Samenvattend kunnen we concluderen dat er niet één cellijn is die in alle aspecten op DCs lijkt. Desalniettemin kan het gebruik van cellijnen, elk voor een eigen toepassing, het onderzoek naar de biologie van DCs vergemakkelijken, zoals ook in dit proefschrift beschreven. Tijdens maturatie veranderen de sterk hechtende iDCs in snel migrerende mDCs (hoofdstuk 3). Dit proces gaat gepaard met veranderingen in het cytoskelet van deze cellen. mDCs hebben dendritische uitlopers, maar geen adhesiestructuren. iDCs hebben z.g.n. 'focal adhesions' (FAs), maar de belangrijkste adhesiestructuren in deze cellen zijn podosomen. Wij hebben ontdekt dat DCs na toevoeging van een maturatie-inducerende combinatie, bestaande uit monocyt-geconditioneerd medium (MCM), TNFα en prostaglandine E2 (PGE2), zeer snel hun podosomen verliezen (hoofdstuk 3). Deze combinatie wordt ook gebruikt bij patiënten met huidkanker die DC-vaccinatie ondergaan. Hierbij is gebleken dat PGE2 onmisbaar is voor het induceren van migratie en goede antitumorresponsen. Onze in vitro experimenten bevestigen dat de toevoeging van PGE2 voldoende is om podosoomdissolutie en snelle migratie te induceren in DCs. In de weefsels komen iDCs in contact met de omringende extracellulaire matrix (ECM) waarbij deze aan verschillende ECM-componenten kunnen binden. In vitro heeft binding aan fibronectine via het α5β1-integrine de voorkeur. Wij hebben aangetoond dat actief α5β1-integrine verrijkt is in podosomen en dat de activiteit van dit integrine vermindert tijdens maturatie (hoofdstuk 3). Als het integrine in zijn actieve vorm gehouden wordt remt dit het oplossen van podosomen en het ontstaan van snelle migratie. Dit wijst erop dat een strikte regulatie van de activiteit van integrines essentieel is voor het functioneren van DCs. Hoewel het oplossen van podosomen (minuten) en het ontstaan van snelle migratie (16 uur) in de tijd van elkaar gescheiden zijn, zien we een sterke correlatie tussen het verdwijnen van podosomen en het ontstaan van snelle migratie. Waarschijnlijk zijn podosomen van belang bij de langzame, fibroblast-achtige migratie van iDCs, maar verhinderen ze de snelle, T-cel-achtige migratie noodzakelijk voor het functioneren van mDCs. Ook hebben we gevonden dat lipopolysaccharide (LPS), een maturatiestimulus afkomstig van de celwand van gramnegatieve bacteriën ook podosoomdissolutie in DCs kan induceren. Dit effect treedt evenwel beduidend later op dan met PGE2. LPS bindt en activeert Toll-like receptor 4 (TLR4). Componenten van Grampositieve bacteriën leiden tot activatie van TLR2, dat dimeren vormt met TLR1 of TLR6. Wij hebben de effecten van Gramnegatieve en Grampositieve bacteriën op DC-maturatie in detail onderzocht (hoofdstuk 4). Tot onze verbazing vonden we dat Gramnegatieve bacteriën of LPS, maar niet Grampositieve bacteriën of pure TLR2 liganden, podosoomdissolutie induceren. Verder blijken de Gramnegatieve bacteriën superieur in het induceren van snelle migratie en expressie van CCR7, de chemokine receptor nodig voor de migratie naar de lymfeknopen. Ook de expressie van costimulatoire moleculen en productie van inflammatoire cytokinen is beduidend hoger na stimulatie van DCs met Gramnegatieve bacteriën dan wanneer hiervoor Grampositieve bacteriën worden gebruikt. Deze bevindingen tonen aan dat Gramnegatieve bacteriën beter zijn in het induceren van DC-maturatie dan Grampositieve bacteriën. De effecten van LPS of Gramnegatieve bacteriën kunnen worden geblokkeerd door TLR4 te blokkeren en zijn afwezig in TLR4-/- muizen beenmerg DCs (BMDCs), wat aangeeft dat dit proces volledig afhankelijk is van TLR4 en dat deze reacties geconserveerd zijn tussen muis en mens (hoofdstuk 4). TLR4 kan twee signaleringsroutes activeren, de ene verlopend via het adaptermolecuul MyD88 en de andere via TRIF. Wij hebben MyD88- en TRIF-deficiënte BMDCs gebruikt om de rol van deze signaleringsroutes op DC-maturatie verder te onderzoeken (hoofdstuk 4). Uit deze studies blijkt dat de effecten van Gramnegatieve bacteriën op maturatie en podosoomverlies, in hoofdzaak TRIF-afhankelijk zijn. Omdat PGE2-stimulatie leidt tot het snel oplossen van podosomen, is onderzocht of de effecten van LPS dan wel Gramnegatieve bacteriën op DCs afhankelijk zijn van de productie van prostaglandines. Het door LPS geïnduceerde podosoomverlies en de snelle migratie blijkt te kunnen worden geremd met indomethacine, een middel dat de productie van prostaglandinen door de COX-enzymen remt (hoofdstuk 3). Op dezelfde manier kunnen de effecten geïnduceerd door Gramnegatieve bacteriën geremd worden met indomethacine (hoofdstuk 4). Deze resultaten bevestigen dat prostaglandines, geproduceerd door DCs na stimulatie met bacteriële antigenen, een belangrijke rol spelen bij de inductie van celmigratie tijdens DC-maturatie. Gezien het belang van prostaglandines zoals PGE2 voor DC-migratie, zijn de signaleringsroutes betrokken bij de PGE2-geïnduceerde podosoomdissolutie verder onderzocht (hoofdstuk 5). Van de vier bekende receptoren voor PGE2, EP1-4, blijken vooral EP2 en EP4 betrokken bij PGE2-geïnduceerde responsen in DCs. Activatie van EP2 en EP4 leidt tot productie van cAMP en het (farmacologisch) verhogen van cAMP-concentraties in de cel kan de PGE2-geïnduceerde effecten nabootsen. Door 'Live Cell Imaging' te combineren met interferentie-reflectie-microscopie (IRM), zijn we in staat geweest om de dynamiek van podosoomverlies in de tijd te volgen (hoofdstuk 5). IRM maakt het mogelijk om adhesiestructuren in levende cellen te volgen in de tijd zonder gebruik te maken van fluorescent-gelabelde moleculen. Gebruikmakend van deze techniek worden podosomen zichtbaar als donkere stippen en FAs als donkere strepen. Behalve tot het verlies van podosomen, leidt PGE2-stimulatie ook tot een toename in het aantal DCs met FAs (hoofdstuk 5). Direct voorafgaand aan het oplossen van de podosomen ontstaat een heldere ring rondom de podosoomkern, hetgeen suggereert dat er een fysische verandering plaatsvindt in deze ringstructuur. FA-formatie en het verlies van podosomen gaat gepaard met contractie (het samentrekken van het cytoskelet) van de DCs. Contractie van het cytoskelet wordt gegenereerd door het motoreiwit myosine II in associatie met het actine cytoskelet. Van de drie vormen van myosine II (A, B en C) komt hoofdzakelijk myosine IIA voor in DCs. Door gebruik te maken van de myosine II remmer blebbistatine hebben we het belang van myosine II(A) in PGE2-geïnduceerde podosoomdissolutie verder kunnen bevestigen (hoofdstuk 5). De vorm van de cel en de organisatie van het cytoskelet worden door verschillende processen beïnvloed, en in belangrijke mate gereguleerd door de GTPases RhoA, Rac1 en CDC42. Daarom is de betrokkenheid van deze GTPases bij de PGE2-geïnduceerde effecten op podosomen onderzocht (hoofdstuk 5). Hieruit blijkt dat activatie van RhoA en RhoA-gemedieerde contractie een essentiële rol speelt bij PGE2-geïnduceerd podosoomverlies. Uit deze resultaten blijkt dat PGE2-stimulatie leidt tot cAMP-verhoging, wat het verlies van podosomen en ontstaan van FAs induceert. Deze effecten zijn een direct gevolg van myosine II-geïnduceerde contractie die ontstaat door activatie van de RhoA-Rho kinase route (hoofdstuk 5). Verder suggereren deze bevindingen dat podosomen en FAs tegengesteld gereguleerd worden door de contractiele status van de cel. De regulatie van elementaire cellulaire functies, zoals differentiatie, apoptose, adhesie en migratie, is afhankelijk van de balans tussen krachten die gegenereerd worden door de ECM aan de buitenkant van de cel en de krachten die ontstaan door myosine II-geïnduceerde contractie in de cel. Integrines die georganiseerd zijn in adhesiestructuren vormen de verbinding tussen de omgeving van de cel en het cytoskelet. Fysische aspecten van het substraat en de cellulaire omgeving kunnen het ontstaan van krachten binnen in de cel beïnvloeden. In hoofdstuk 6 hebben we de effecten van deze fysische aspecten op DC-adhesie en het ontstaan van podosomen onderzocht. Het vermogen van DCs om te hechten en om podosomen en FAs te vormen op tweedimensionale substraten lijkt onafhankelijk van het type substraat of het hydrofobe karakter ervan. Om de effecten van topologie en omvang van het substraatoppervlak te onderzoeken is gezocht naar een substraat waarop de DCs niet kunnen hechten, maar dat zodanig behandeld kan worden dat de DCs lokaal wel kunnen hechten. Hydrogels blijken aan deze eigenschappen te voldoen. Eiwitten en zelfs grotere deeltjes geïmmobiliseerd op deze hydrogels geven aanleiding tot DC-adhesie en podosoomvorming. Hydrogels kunnen worden gebruikt in combinatie met microcontact printing, wat een meer gecontroleerde afmeting en plaatsing van de eiwit-gecoate oppervlakken toelaat. Het gebruik van hydrogels in combinatie met microcontact printing lijkt dan ook een goede methode om de rol van substraatgrootte en afstand te onderzoeken (hoofdstuk 6). Ook is het effect van reliëfverschillen in het substraat op DC-adhesie en podosoomvorming onderzocht gebruikmakend van substraten met richels en anders gevormde hoogtestructuren. DCs vormen specifiek podosomen op de randen van deze hoogtestructuren (hoofdstuk 6). Dit suggereert dat de hoek van het substraat een kromming van de celmembraan induceert wat resulteert in mechanische stress die leidt tot lokale podosoomformatie. De effecten van reliëfverschillen op podosoomformatie suggereren dat podosomen mechanosensoren kunnen zijn, net als FAs. De invloed van mechanische effecten op podosoomvorming en -regulatie zou gevolgen kunnen hebben op het gedrag van DCs in de verschillende weefsels en tijdens het verlaten van de weefsels. Samenvattend tonen de bevindingen in dit proefschrift aan dat adhesiestructuren (met name podosomen) strikt gereguleerd worden tijdens DC-maturatie. Deze regulatie speelt een belangrijke rol bij de inductie van snelle migratie vanuit de weefsels naar de lymfeklieren, een voorwaarde voor goede T-cel-activatie. List of abbreviations -/- knock out Ab antibody AFM atomic force microscopy APC antigen presenting cell BMDCs bone marrow-derived DCs BSA bovine serum albumin cAMP cyclic adenosine monophosphate CBA cytokine beads array COX cyclooxygenase CTL cytotoxic T lymphocyte DCs dendritic cells DC-SIGN DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin DEAE diethylaminoethyl DNA desoxyribonucleic acid ECM extracellular matrix ELISA enzyme-linked immunosorbent assay FAs focal adhesions FCS fetal calf serum FITC fluorescein isothiocyanate FN fibronectin g gram GM-CSF Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor GTP Guanosine triphosphate h hour HLA human leukocyte antigen ICAM intercellular adhesion molecule iDCs immature DCs IFN interferon IL interleukin IRF IFN-regulatory factor IRM Interference Reflection Microscopy KLH keyhole limpet hemocyanin l liter LPS lipopolysaccharide LTA lipoteichoic acid MAL MyD88 adaptor-like MCM monocyte conditioned medium MDA-5 melanoma differentiation-associated gene 5 mDCs mature DCs MFI mean fluorescent intensity MHC major histocompatibility complex min minutes MODCs monocyte-derived DCs moi mode of infection MyD88 myeloid differentiation primary response gene 88 myDCs myeloid DCs MΦ macrophage NF-κB nuclear factor κB NK cell natural killer cell NOD nucleotide-binding oligomerization domain PAMPs pathogen associated molecular patterns PBMCs peripheral blood mononuclear cells PBS phosphate buffered saline Pd pull down pDCs plasmacytoid DCs PDMA poly(dimethyl siloxane) PE phycoerythrin PEG poly(ethylene glycol) PEN poly(ethylene naphthalate) PGE2 prostaglandin E2 PGs prostaglandins PKA protein kinase A PLL poly-L-lysine PMA phorbol 12-mystate 13-acetate PMMA poly(methyl methacrylate) polyI:C polyinosinic-polycytidylic acid PRRs pattern recognition receptors PS polystyrene RIG retinoic acid-inducible gene RNA ribonucleic acid RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction SD (s.d.) standard deviation SEM (s.e.m.) standard error of the mean Th T helper TL total lysate TLRs Toll-like receptors TNFα Tumor Necrosis Factor α TRAM TRIF-related adaptor molecule TRIF TIR domain-containing adaptor-inducing IFN WASp Wiskott Aldrich Syndrome protein WT wild-type