Joost Ballering

Sinds mensenheugenis proberen wij te begrijpen hoe de wereld om ons heen functioneert. Deze zoektocht vloeit voort uit de verwondering over alles wat we om ons heen kunnen waarnemen. Bijdragen aan ons begrip van de natuur zijn van alle tijden. De ontwikkeling van de wiskunde, filosofie en sterrenkunde gaat terug tot de oude beschavingen van Griekenland, Egypte, Mesopotamië, de Indusvallei, China en de Maya’s. Tijdens de Europese Renaissance veranderde men geleidelijk de traditionele methoden en werd de logica als maat van alle dingen genomen. De wens van zowel kunstenaars als wetenschappers om de zaken weer te geven zoals ze zijn - in tegenstelling tot het verder uitbouwen van bestaande theorieën - leidde tot zorgvuldig observeren en experimenteren onder gecontroleerde omstandigheden. Om de kwaliteit van zijn schilderijen te verbeteren ontleedde Leonardo da Vinci systematisch tientallen lijken en maakte prachtige, realistische tekeningen waarmee hij de menselijke anatomie in meer detail weergaf dan ooit tevoren. Vesalius, een beroemde anatoom, huurde kunstenaars in om illustraties van zijn dissecties te maken. In de 17e eeuw culmineerden de nieuwe opvattingen en werkwijzen van de Renaissance in een wetenschappelijke revolutie en werd de moderne praktijkgerichte experimentele wetenschap geboren. Nieuwe paradigma’s ontstonden in de natuur- en sterrenkunde en door de uitvinding van de microscoop konden voor het eerst cellen worden waargenomen. Die cellen werden erkend als basiseenheden van alle organismen en de zogenaamde celtheorie ontstond, bestaande uit drie stellingen. 1) Alle levende organismen bestaan uit één of meer cellen, 2) de cel is de basiseenheid van structuur en organisatie en 3) alle cellen komen voort uit reeds bestaande cellen. In de 19e eeuw werd de celtheorie algemeen aanvaard, maar een intrigerende vraag bleef: wat is de aard van het celmembraan, het vlies om de cel, dat selectief transport van stoffen de cel in en uit mogelijk maakt en daardoor feitelijk de cel definieert? Het zou tot de 20e eeuw duren voordat zowel de chemische samenstelling als de structuur van het celmembraan werden ontrafeld. We weten nu dat het celmembraan hoofdzakelijk uit lipiden en eiwitten bestaat.

Vele eigenschappen van het celmembraan worden bepaald door de lipiden. Lipiden zijn opgebouwd uit een hydrofobe staart en een hydrofiele kopgroep. In waterige oplossingen hebben de hydrofobe staarten de neiging om te aggregeren, zodat de verstoring van de energetisch gunstige waterstofbruggen minimaal is. Dit verschijnsel wordt het hydrofobe effect genoemd en het is de drijvende kracht voor lipiden om structuren te vormen zoals micellen of bilagen. De meeste lipiden in waterig milieu vormen spontaan bilagen, dat wil zeggen twee lagen met de staarten bij elkaar in een hydrofobe kern en de hydrofiele kopgroepen gericht naar de waterige omgeving. In biologische membranen zijn de lipiden geordend in bilagen. Deze bilagen zijn zeer impermeabel voor ionen en de meeste polaire moleculen, met uitzondering van water. Door deze eigenschappen is de bilaag een uitstekende barrière tussen de binnen- en de buitenkant van de cel. Veel stoffen moeten echter op een gecontroleerde manier de cel binnenkomen of verlaten. Voor deze en andere functies zijn cellen afhankelijk van een andere component van het membraan: de membraaneiwitten.

Het grootste deel van de dynamische processen die plaatsvinden in biologische membranen wordt uitgevoerd door membraaneiwitten. Deze eiwitten bevinden zich aan het membraanoppervlak of ze doorkruisen het membraan waardoor ze ingebed zijn in het membraan. De in het membraan geïntegreerde eiwitten hebben een karakteristieke structuur, meestal gevormd door één of meerdere membraanoverspannende α-helices. Deze helices zijn bijvoorbeeld betrokken bij de vorming van kanalen en pompen die zorgen voor selectief transport over het membraan. Bij receptoren en sensoren zijn transmembraan helices verantwoordelijk voor het overdragen van informatie over het membraan, wat resulteert in activering of deactivering van vitale cellulaire processen. Hierbij is de interactie tussen eiwitten en lipiden in het bijzonder van belang. Daarom is, naast de studie van membraaneiwitten zelf, onderzoek naar hoe deze eiwitten worden beïnvloed door de lipide omgeving van cruciaal belang.

Celmembranen zijn zeer dynamische structuren en worden wel voorgesteld als een tweedimensionale vloeistof. Individuele lipide- en eiwitmoleculen kunnen diffunderen in het vlak van het membraan. Anderzijds is diffusie loodrecht op het membraanvlak, ofwel de translocatie van een molecuul naar de tegenover liggende monolaag in het membraan, een veel trager proces. De viscositeit of vloeibaarheid van het membraan is een biologisch belangrijke eigenschap. Membraaneiwitten kunnen alleen functioneren in een vloeibaar membraan. In stuggere membranen worden belangrijke functies als transport en signaaltransductie verstoord wat uiteindelijk celdood tot gevolg heeft. Daarom wordt de vloeibaarheid van het membraan zorgvuldig gereguleerd in alle organismen. De vloeibaarheid van het membraan wordt onder andere beïnvloed door de temperatuur en de samenstelling van het membraan. Daarom reguleren bacteriën hun membraansamenstelling afhankelijk van de omgevingstemperatuur. Die regulering van membraanvloeibaarheid in bacteriën is het hoofdonderwerp van dit proefschrift.

Ondanks hun microscopisch kleine afmetingen hebben bacteriën een belangrijke invloed op alle leven op aarde. Hun leefomgeving varieert van de bodem of het water tot zure warmwaterbronnen of Arctische omgevingen. Verder leven bacteriën ook in symbiotische of parasitaire relaties met dieren en planten. Met ongeveer 10^30 bacteriën op aarde, vormen ze een biomassa die veel groter is dan die van alle planten en dieren samen. Bacteriën recyclen voedingsstoffen, hebben invloed op de biosfeer en veroorzaken ziekte. Voor een beter begrip van de biologische mechanismen in het bacteriële koninkrijk worden verschillende zogenaamde modelorganismen uitgebreid bestudeerd, met de verwachting dat ontdekkingen in deze organismen inzicht geven in het functioneren van andere organismen. Binnen deze modelorganismen is detectie en signalering een intrigerend onderwerp, omdat het ingaat op de fundamentele vraag hoe bacteriën hun omgeving waarnemen. Beter begrip van de processen die betrokken zijn bij detectie en signalering kan leiden tot nieuwe antibiotica, omdat we dan kunnen onderzoeken hoe we deze processen kunnen verstoren.

In dit proefschrift is het bacteriële thermostaateiwit DesK van de bacterie Bacillus subtilis onderzocht. Dit is een sensor die zich in het membraan van de bacterie bevindt en daar verlaging van de omgevingstemperatuur kan meten. Temperatuurverlagingen hebben en verstarrend effect op het membraan. Daarom is het van levensbelang voor de bacterie dat een verlaagde temperatuur gemeten wordt en dat, als reactie daarop, direct meer vloeibare componenten aan het membraan worden toegevoegd. DesK reageert dan ook op een verlaagde temperatuur door een cascade in werking te stellen die resulteert in verhoging van het aantal vloeibare componenten in het membraan. Hierdoor wordt de verlaagde membraanvloeibaarheid als gevolg van de temperatuur gecompenseerd.

Omdat DesK de temperatuur binnen in het membraan waarneemt, zijn eiwit-lipide interacties cruciaal voor het mechanisme van detectie en signaaltransductie. In principe kunnen deze interacties worden onderzocht door eiwitten in hun oorspronkelijke lipide omgeving te bestuderen. Dit is echter niet eenvoudig en maakt systematische studies bijna onmogelijk. Gelukkigerwijs werd in 2010 een vereenvoudigde zogenaamde minimale sensor van DesK (MS-DesK) ontdekt, die de bestudering van dit thermostaateiwit vergemakkelijkt. MS-DesK heeft slechts één transmembraan helix in plaats van vijf. Als ook het complexe mengsel van membraanlipiden vervangen wordt door synthetische lipiden, ontstaat een membraansysteem met sterk gereduceerde complexiteit, een zogenaamd model membraansysteem. Deze modelsystemen zijn voor onderzoek naar het mechanisme van DesK zeer geschikt omdat zowel de detectie als de signaaltransductie plaats vindt binnen het membraan en omdat DesK specifieke membraaneigenschappen waarneemt die in model systemen systematisch gevarieerd kunnen worden zodat de bijdrage van elke eigenschap kan worden onderzocht. Eiwit-lipide interacties zijn hierbij van cruciaal belang, omdat deze interacties direct verantwoordelijk zijn voor de activatie van DesK.

De benadering met model membraansystemen werd gebruikt in de hoofdstukken 2 en 3, waar het MS-DesK transmembraan segment werd onderzocht in membranen met verschillende dikte, lipide-fase en lading. De modelsystemen werden bestudeerd met circulair dichroïsme, tryptofaan fluorescentie en moleculaire simulaties, aangevuld met in vivo activiteitsbepalingen. Met behulp van deze complementaire technieken vonden we een temperatuurafhankelijke verandering in conformatie van de MS-DesK transmembraan helix en konden we een moleculair model van de detectie en signaaltransductie van DesK construeren, dat verderop behandeld zal worden.

Om het systeem meer overeen te laten komen met de in vivo situatie, werden de synthetische lipiden in de model membraansystemen vervangen met lipide extracten van B. subtilis bacteriën. Deze extracten werden eerst gekarakteriseerd en we vonden een temperatuurafhankelijke regulatie van de lipid samenstelling. Het resultaat van de activiteit van twee mechanismen om de vloeibaarheid te verhogen werd waargenomen: verlaging van het verzadigingsniveau van de lipiden en verandering van het vertakkingspatroon van de lipiden. In de model membraansystemen met de B. subtilis lipiden werd echter geen temperatuurafhankelijke verandering in conformatie van de MS-DesK transmembraan helix waargenomen. Een mogelijke verklaring kan zijn dat de heroriëntatie van de MS-DesK helices wordt gehinderd door de aanwezigheid van de B. subtilis lipiden. Bovendien heeft MS-DesK in vivo een intracellulair domein, dat binding van de C-terminus van de MS-DesK transmembraan helix met het membraan zou kunnen voorkomen, waardoor de heroriëntatie van de helix makkelijker zou kunnen worden. Tot slot zouden andere eiwitten in de B. subtilis membraan invloed kunnen hebben op de heroriëntatie van het MS-DesK transmembraan segment.

In hoofdstuk 5 werd de oligomerizatietoestand van MS-DesK onderzocht met behulp van een heel ander model membraansysteem. We onderzochten het gebruik van een styreen maleïnezuur polymeer, dat membranen oplost in zogenaamde nanodiscs. Twee manieren om deze nanodiscs te gebruiken werden in deze studie onderzocht. De eerste benadering is gebaseerd op de biochemische karakterisering van gezuiverde nanodiscs met transmembraanpeptiden. De tweede benadering maakt gebruik van chemisch cross-linken van de peptiden in de nanodiscs. De resultaten tonen dat deze beide methoden veelbelovende hulpmiddelen zijn voor de karakterisering van oligomerizatietoestanden van eiwitten. Verdere optimalisatie is echter noodzakelijk.

De studies in dit proefschrift resulteerde in een model van detectie en signaaltransductie van MS-DesK. Het thermostaateiwit vormt een dimeer en detecteert de temperatuur binnen in het membraan. MS-DesK reageert niet op temperatuur zelf, maar vermoedelijk op een afname van membraanvloeibaarheid en een overeenkomstige stijging van membraandikte. Als reactie verlengt de MS-DesK transmembraan helix, wat drie serine residuen aan één zijde van de helix brengt. Zo wordt een zogenaamd serine-rits motief gevormd. Het contact van deze hydrofiele serine-rits met de hydrofobe membraan is energetisch ongunstig. Een heroriëntatie van de helices maakt optimale vorming van waterstofbruggen mogelijk tussen de twee helices van de MS-DesK dimeer. Het eindresultaat is de vorming van een stabiele en continue helix van het membraan naar het cytoplasma, waardoor de kinase conformatie van de sensor gevormd wordt. Dit heeft de fosforylering van een respons regulator tot gevolg, waardoor een desaturase tot expressie komt dat door incorporatie van dubbele bindingen in bestaande lipiden de membraanvloeibaarheid weer verhoogd.

De precieze aard van de heroriëntatie van de transmembraan helices van de MS-DesK dimeer kan nog niet met zekerheid worden vastgesteld. Mogelijk zijn kleine rotaties, schuivende bewegingen en / of veranderingen in tilt tussen de helices betrokken bij de signaaltransductie. Er wordt inderdaad verondersteld dat dit soort bewegingen betrokken is bij verschillende detectie en signaaltransductie mechanismen. Maar verder onderzoek moet uitwijzen welke bewegingen daadwerkelijk betrokken zijn bij het doorgegeven van het signaal naar het intracellulaire domein van DesK.