Jasmine Bracher

In 2017 tekenden bijna 200 partijen het klimaatakkoord in Parijs waarmee zij zich committeerden aan het doel om de gemiddelde wereldwijde temperatuurstijging onder de 2 graden te houden. Bijna alle mogelijke scenario’s die gebaseerd zijn op dit doel omvatten een sterke toename in het gebruik van biobrandstof voor transport ter land, ter zee en in lucht. In tegenstelling tot fossiele brandstof maken biobrandstoffen, in principe, een gesloten koolstofcyclus mogelijk. De biobrandstof ethanol wordt gevormd door microbiële vergisting van plantaardig zetmeel, rietsuiker of reststromen uit de landbouw. Deze vloeibare brandstof is een direct implementeerbaar alternatief voor fossiele brandstof, omdat het de voordelen van duurzame brandstofproductie combineert met toepasbaarheid in bestaande verbrandingsmotoren zonder dat hiervoor dure modificaties van de huidige brandstofinfrastructuur nodig zijn.

Momenteel is bioethanol, binnen de industriële biotechnologie, het product dat met het grootste volume geproduceerd wordt. 99% van deze ethanol wordt geproduceerd in zogenaamde “eerste generatie”-processen waarin bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) de koolhydraten uit suikerriet of mais fermenteert. “Tweede generatie” bioethanol, waarvoor de eerste fabrieken op industriële schaal nu worden gestart, wordt gemaakt door vergisting van suikers die afkomstig zijn van lignocellulose-bevattende plantaardige biomassa. Deze biomassa is afkomstig van landbouwafval zoals tarwestro en suikerbietenpulp en maakt een “voedsel en brandstof” scenario mogelijk. De industriële implementatie van deze processen brengt echter wel uitdagingen met zich mee voor de gist en voor biotechnologen. Hydrolyse van lignocellulose-bevattende biomassa levert een mengsel van suikers afkomstig van cellulose en hemicellulose, maar ook verbindingen die de groei en levensvatbaarheid van S. cerevisiae negatief beïnvloeden.

Qua suikersamenstelling bevat de gehydrolyseerde lignocellulose, naast glucose, ook 30% d-xylose en 2 – 20% l-arabinose. Wildtype stammen van S. cerevisiae zijn niet in staat de pentoses d-xylose en l-arabinose te fermenteren. Daarom heeft internationaal onderzoek zich in de afgelopen twee decennia gericht op strategieën waarbij de stofwisseling van S. cerevisiae zo wordt aangepast dat de anaërobe omzetting van d-xylose en l-arabinose naar ethanol mogelijk wordt. Een combinatie van genetische aanpassingen van S. cerevisiae geeft deze gist het vermogen de genoemde pentoses om te zetten. Hiervoor moeten stofwisselingsroutes gebaseerd op d-xylose- en l-arabinose-isomerase, afkomstig uit andere schimmels en bacteriën, gecombineerd worden met het tot overexpressie brengen van het niet-oxidatieve gedeelte van de pentosefosfaatroute en deletie van het niet-specifieke aldose-reductasegen GRE3. Ontwikkelingen in methoden om de stofwisseling van gist aan te passen, zoals het aanpassen van het genoom met behulp van CRISPR-Cas9, hebben de constructie en het karakteriseren van S. cerevisiae stammen waarin de kinetiek, robuustheid en ethanolopbrengst in tweede-generatie processen zijn verbeterd, mogelijk gemaakt.

HOOFSTUK 1 van dit proefschrift vat de geschiedenis en recente vooruitgang in het aanpassen van de stofwisseling van S. cerevisiae van productie van ethanol samen vanuit een academisch en industrieel perspectief.

Opname van glucose door S. cerevisiae is efficiënt en omvat een complexe regulatie van genen en de in vivo activiteit van 20 hexose-transporteiwitten. Deze transporteiwitten hebben een brede reikwijdte in affiniteit voor glucose en het vermogen om op verschillende concentraties van glucose te reageren. Hoewel een vergelijkbaar systeem voor de opname van pentoses niet is geëvolueerd in S. cerevisiae, hebben verschillende hexosetransport-eiwitten ook affiniteit voor d-xylose en maken transport van deze pentose mogelijk. l-arabinose transport is daarentegen vooral afhankelijk van één galactose-transporteiwit, Gal2. Dit transporteiwit heeft een lage affiniteit voor l-arabinose en de expressie van GAL2 wordt sterk onderdrukt door glucose, dat veel voorkomt in gehydrolyseerd lignocellulose. Glucose is hierdoor een sterke en industrieel relevante remmer van l-arabinose opname door Gal2. De combinatie van lage affiniteit en repressie door glucose leidt tot een langere fermentatietijd, omdat hierdoor eerst glucose en dan pas l-arabinose opgenomen wordt. Dit wordt met name aan het einde van fermentatieprocessen duidelijk door een “naijleffect” dat zichtbaar een langzame afname van de l-arabinoseconcentratie. Dit naijleffect heeft negatieve gevolgen voor de productiviteit van de ethanol productie.

De doelstelling van HOOFDSTUK 2 van dit proefschrift was het verbeteren van de affiniteit van l-arabinose transport in genetisch aangepaste, l-arabinosefermenterende S. cerevisiae -stammen. Door het analyseren van transcriptoomdata van Penicillium chrysogenum, gekweekt in een chemostaat met l-arabinose als limiterend substraat, konden kandidaat-transporteiwitten voor deze suiker geïdentificeerd worden. De op deze manier geïdentificeerde genen werden elk tot expressie gebracht in een S. cerevisiae-stam waarin GAL2 was verwijderd, waardoor onderzocht kon worden welke van de genen groei op l-arabinose mogelijk maakten. In tegenstelling tot Gal2 gaf het Penicillium-transporteiwit PcAraT, de mogelijkheid om l-arabinose op te nemen in de aanwezigheid van glucose. Hierdoor konden, in theorie, deze twee suikers gelijktijdig gefermenteerd worden. Opname-experimenten met radioactief gemerkte suikers toonden aan dat PcAraT een zeer hoge affiniteit voor l-arabinose had en dat dit eiwit geen glucose of d-xylose transporteerde. De residuele l-arabinoseconcentratie in chemostaatcultures was vierhonderdvijftig keer lager voor stammen die PcAraT tot expressie brachten dan voor vergelijkbare stammen die l-arabinose alleen konden transporteren via Gal2. Deze waarneming ondersteunde de experimenten met radioactieve suikers en bevestigde dat PcAraT een bijdrage kan leveren aan de constructie van nieuwe l-arabinose-fermenterende S. cerevisiae stammen. De introductie van PcAraT in S. cerevisiae zorgde voor een glucose-ongevoelige l-arabinose-opname met een hoge affiniteit, die vooral relevant is om de residuele l-arabinose aan het einde van een fermentatie op te nemen. Echter, expressie van PcAraT maakte geen snel transport van l-arabinose mogelijk. Het endogene galactosetransporteiwit Gal2 kan l-arabinose wel snel transporteren, maar de expressie van Gal2 wordt onderdrukt door glucose.

Het doel van HOOFDSTUK 3 van dit proefschrift was het verbeteren van de capaciteit van genetisch aangepaste, l-arabinose consumerende, S. cerevisiae om l-arabinose te transporteren. Hierbij werd gebruik gemaakt van glucose-xylose-arabinose medium om gelijktijdige fermentatie van deze suikers en, uiteindelijk, een afname van de totale fermentatietijd mogelijk te maken. Hiervoor werd S. cerevisiae stam gemaakt die PcAraT tot expressie bracht maar geen glucose kon fosforyleren, waardoor deze stam glucose kon opnemen maar niet verder kon omzetten. Door evolutie in het laboratorium, waarbij gebruik werd gemaakt van een sequentiële anaërobe batchcultures op glucose-xylose-arabinose medium, kon geselecteerd worden op cellen die l-arabinose konden opnemen in de aanwezigheid van een hoge concentratie van de andere suikers. Na ‘whole genome sequencing’ werden duplicaties van het gen voor de GAL2 transporteiwit en verschillende mutaties binnen dit gen aangetroffen in onafhankelijk geëvolueerde cellijnen. De relevantie van individuele mutaties werd onderzocht door deze ongedaan te maken in de verschillende geëvolueerde stammen en door deze mutaties in de wildtype stam te introduceren. Daarnaast werd transport kwantitatief bestudeerd met radioactief gemerkte suikers. Alleen Duplicatie van Gal2 was niet voldoende om directe anaërobe groei op l-arabinose mogelijk te maken, maar een aantal mutaties resulteerde in Gal2 varianten met verbeterd l-arabinosetransport. Het allel GAL2N371T, T89I codeerde voor een glucose-onafhankelijk l-arabinose transport en leidde tot verlies van glucosetransport. Een tweede geëvolueerd allel, GAL2N376T, had een verhoogde l-arabinosetransportcapaciteit, die ten koste ging van de capaciteit om glucose te transporteren. Een derde allel, GAL2T89I, had een verlaagde affiniteit voor glucose terwijl de algehele affiniteit voor l-arabinose groter geworden was. Deze veranderingen gingen ten koste van de capaciteit om beide suikers te transporteren. Toen dit allel werd vervangen door een wildtype allel, verdubbelde de fermentatietijd van 20 g L-1 l-arabinose in het glucose-arabinose-xylose medium (van 25 naar 45 uur). Deletie van PcAraT in dezelfde stam verlaagde de groeisnelheid van 0.12 uur-1 tot 0.1 uur-1, waardoor de totale fermentatietijd toenam. Met de ontdekking en functionele expressie van PcAraT in S. cerevisiae en de selectie voor en karakterisering van de gemuteerde Gal2-allelen met –verbeterde l-arabinose– transport in de aanwezigheid van glucose, zijn belangrijke elementen geleverd voor een verbeterde fermentatie van l-arabinose en de productie van nieuwe giststammen voor 2de generatie bioethanolproductie.

Omdat de suikers uit lignocellulose biomassa voor 30% bestaan uit d-xylose, is de anaërobe vergisting van deze suiker essentieel voor een productief economisch proces. Het is daarom niet verrassend dat een significant gedeelte van het onderzoek naar het gebruik van S. cerevisiae in de bioethanolproductie zich heeft gericht op anaërobe fermentatie van d-xylose. Publicaties over d-xylosefermenterende S. cerevisiae-stammen die xylose-isomerase tot expressie brengen, komen tot tegenstrijdige conclusies over de noodzaak van evolutie in het laboratorium om anaërobe groei op d-xylose mogelijk te maken. Twee publicaties van de Industriële Microbiologie-groep van de TU Delft, die dezelfde stam en vergelijkbare genetische modificaties gebruikten, rapporteerde in een studie directe anaërobe groei op xylose terwijl in de andere studie evolutie en een additionele mutatie nodig waren om anaërobe groei op deze pentose mogelijk te maken.

In HOOFDSTUK 4 van dit proefschrift zijn de vereisten voor anaërobe groei op d-xylose van gemodificeerde S. cerevisiae-stammen met een CEN.PK achtergrond, opnieuw onder de loep genomen. De reconstructie van de stammen met het vermogen tot vergisting van d-xylose resulteerde in de identificatie van subtiele verschillen in de gebruikte kweekmethoden, die grote gevolgen hadden voor anaërobe groei. Vooral de dichtheid waarmee een culture geënt bleek hierbij van groot belang. Als een entdichtheid van 0.2 g biomassa L-1 gebruikt werd, begon de cultuur direct te groeien terwijl het 7–8 dagen durende voordat een cultuur met een entdichtheid van 0.02 g biomassa L-1 begon te groeien. Door het doorleiden van met CO2 verrijkt stikstofgas door cultures met een lage entdichtheid culture kon de initiële, hogere, CO2- concentratie in cultures met een hoge entdichtheid gesimuleerd worden. In deze cultures, en ook in cultures waarin l-aspartaat in plaats van ammonium als stikstofbron werd gebruikt, begon anaërobe groei vrijwel meteen Ook kon door het weglaten van overexpressiecassettes voor NQM1 en TKL2, twee paralogen van pentosefosfaatroutegenen, kon een genetisch aangepaste stam geconstrueerd worden die direct d-xylose begon te fermenteren bij een lage entdichtheid, zelfs wanneer de reactor met puur stikstofgas doorborreld werd. Deze waarnemingen losten de schijnbare tegenstellingen in de literatuur op over strategieën om met genetische aanpassingen S. cerevisiae anaeroob d-xylose te laten fermenteren. Daarnaast vergrootten deze resultaten de kennis over de mogelijke relevantie van de beschikbaarheid van CO2 en anaplerotische carboxyleringsreacties op anaerobe d-xylose-fermentatie door genetisch gemodificeerde S. cerevisiae-stammen.

Om de standaardisering en reproduceerbaarheid van wetenschappelijke resultaten te bewaken, worden in zowel academische als industriële context, vitamines aan kweekmedia toegevoegd. Hiermee wordt limitatie van deze componenten tijdens de kweek van gist voorkomen. Onderzoek naar de precieze behoefte aan vitamines en prototrophieën (het vermogen van de cel bepaalde vitamines te maken), kan de kosten van medium mogelijk significant verminderen. In het genoom van de laboratoriumstam S. cerevisiae CEN.PK113-7D kon de complete biosynthetische route voor de vitamine biotine synthese geïdentificeerd worden. Desondanks groeide deze stam heel slecht, met een bijna onmeetbaar lage snelheid, in medium zonder biotine.

HOOFDSTUK 5 van dit proefschrift was geïnspireerd door een academische interesse om de nog onbekende aspecten van biotinesynthese in S. cerevisiae te ontrafelen. Daarnaast is een biotine-prototrofe stam vanuit zowel industrieel als academisch perspectief interessant. Door gebruik van parallelle sequentiële batchcultures en een accelerostaatregime in media zonder dit dure supplement, konden variantie van de CEN.PK113-7D-stam geselecteerd worden die snel groeiden in de afwezigheid van biotine. In de geëvolueerde stammen werd met behulp van ‘whole-genome-sequencing’ en ‘reverse metabolic engineering’ een amplificatie van het gen BIO1 geïdentificeerd, die de verbeterde groei in medium zonder biotine grotendeels verklaarde. Deletie van genen die codeerden voor de transporteiwitten Tpo1 en/of Pdr12, die geïnactiveerd waren in geëvolueerde stammen, zorgde voor een verdere verbetering van de groei van stammen die BIO1 tot overexpressie brachten. De identificatie van kandidaat genen voor het maken van biotineprototrofe stammen in HOOFDSTUK 5 kan de kosten van veel biotechnologische producten positief beïnvloeden en toekomstige onderzoekers inspireren de gebruikte methoden in te zetten voor andere dure mediumsupplementen.