Hui Ying Yeoh

Eiwitten zijn verantwoordelijk voor de uitvoerende functies van de cel en ze komen voor als oplosbare en membraan-gebonden versies, waarvan de laatsten in de plasmamembraan van de cel zitten en daarom aangeduid worden als transmembraan (TM)-eiwitten. Hiervan zijn er ongeveer half zo veel als van het aantal oplosbare eiwitten. Een TM-eiwit kan een of meerdere keren met een hydrofoob TM-domein (TMD) door het membraan rijgen. TM-eiwitten vervullen een grote verscheidenheid aan functies, zoals o.a. het transporteren van kleine moleculen en ionen, doorgeven van signalen van buiten de cel naar binnen en vice versa, en het hechten van cellen aan elkaar. Membraaneiwitten worden gemaakt in het endoplasmatisch reticulum (ER), een compartiment dat specifiek is uitgerust met een zogenaamde chaperonne-machinerie om eiwitten te laten vouwen tot een vorm die nodig is voor hun functie. Het deel van een TM-eiwit dat zich in het cytosol bevindt, wordt door een andere groep chaperonnes gevouwen. In tegenstelling tot de grote kennis die we hebben over de vouwing van dit deel van een TM eiwit, weten we weinig over de mechanismen hoe TM chaperonnes bijdragen aan de vouwing van een TMD, o.a. omdat het pas sinds kort mogelijk is deze vraag experimenteel te benaderen.

In Hoofdstuk 1 zetten we op een rij hoe membraangebonden chaperonnes een rol zouden kunnen spelen bij het vouwen van TM-eiwitten aan de hand van CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), ons modeleiwit. CFTR is lid van de ABC-transporterfamilie en heeft twee TMDs, twee cytoplasmatische nucleotide bindende domeinen (NBDs) en een ongestructureerd R-domein. In de architectuur van CFTR zijn TMD1, NBD1, R, TMD2 en NBD2 in deze volgorde aan elkaar geschakeld, een arrangement dat karakteristiek is voor de ABC-transporterfamilie. De structuur van CFTR, met afwisselende gedeeltes in het cytosol, in de membraan en buiten de cel, komt ook voor bij andere membraaneiwitten en vormt een grote uitdaging voor de eivitvouwingsmachinerie. Hierdoor is CFTR een ideaal model voor het ophelderen van de vouwing van complexe membraaneiwitten. Verstoring van de CFTR-functie door erfelijke afwijkingen in de DNA volgorde kan Cystic Fibrosis (taaislijmziekte) veroorzaken. Bij deze ziekte vormen zich slijmophopingen in de luchtwegen, het spijsverteringskanaal en de voortplantingsorganen. In longen worden hierdoor de ingeademde bacteriën niet voldoende efficiënt afgevoerd waardoor infecties ontstaan, die uiteindelijk de meest voorkomende doodsorzaak voor patiënten zijn. Inzicht in CFTR-vouwing zal daarom ook medisch relevante informatie over de ziekte opleveren.

In Hoofdstuk 2 hebben we methoden beschreven voor het meten en analyseren van CFTR-vouwing met behulp van radioactieve ‘pulse chase’. Pulse-chase labeling met radioactieve aminozuren voor nieuw te vormen eiwitten is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van eivitvouwing, het vervoer van eiwitten tussen organellen en de afbraak van eiwitten in cellen. In deze benadering wordt een kleine fractie van de totale hoeveelheid eiwit tijdens haar aanmaak radioactief gelabeld gedurende korte radiolabelingstijden (‘pulse’). Vouwing kan worden gevolgd gedurende de ‘chase’ waar geen radioactieve bouwstenen meer aanwezig zijn. In combinatie met ‘limited proteolysis’, immunoprecipitatie met domeinspecifieke antilichamen en reducerende SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), kunnen vouwingsprocessen van het te bestuderen eiwit tot in detail worden onderzocht.

CFTR vouwt bij benadering in twee stappen, waarbij de domeinen eerst individueel vouwen tijdens de synthese. Wanneer deze stap is voltooid, assembleren de domeinen tot een functioneel eiwit. Het is daarom belangrijk om de vouwing van elk domein te begrijpen, aangezien dit direct verband houdt met de vorm en functtie van het gehele CFTR. Vanwege het gebrek aan geschikte reagentia is het vouwen van CFTR transmembraandomeinen (TMDs) en hun assemblage nog slechts ten dele begrepen. We hebben daarom antilichamen tegen TMD1 en TMD2 gemaakt om het vouwen van de TMDs te bestuderen in Hoofdstuk 3. Met deze antistoffen konden we laten zien dat de TMDs post-translationele vormveranderingen ondergaan die het resultaat zijn van domeinassemblage van CFTR.

Vervolgens werden de nieuwe antilichamen ingezet om het vouwen van een reeks CFTR patiënten-mutanten te bestuderen (Hoofdstukken 4 en 5). In Hoofdstuk 5 hebben we aangetoond dat de milde R751L-mutant vergelijkbaar vouwt en reageert op geneesmiddelen als wild-type CFTR. In Hoofdstuk 4 hebben we CFTR klasse-IV mutanten onderzocht, waarvan we ondermeer hebben vastgesteld dat mutatie R347P verkeerd is geclassificeerd. R347P is de enige mutatie in klasse IV die leidt tot grotere defecten in domeinassemblage. Aangezien R347 zich bevindt in TMD1, kan een mutatie van arginine naar proline de interactie tussen de TMDs van CFTR verstoren en daarmee ook de domeinassemblage. R347P reageert niet op het onlangs goedgekeurde geneesmiddel VX-770, dat het CFTR kanaal opent, terwijl de meeste andere klasse-IV-mutanten er wel op reageren. Door dit criterium en door de functionele verbetering door corrector-geneesmiddel VX-809, kwalificeren we R347P dan ook als een klasse II-mutatie. Onze studie toonde aan dat de nieuwe antilichamen conformatie-defecten in CFTR kunnen detecteren en een nieuwe benadering bieden voor het karakteriseren van de werkingswijze van nieuwe therapeutische middelen. Deze antilichamen kunnen daarom worden gebruikt om te onderzoeken welke geneesmiddelen effectief zijn voor welke variant van taaislijmziekte.

R347 is een van de geladen aminozuren in het eerste TMD van CFTR. Dergelijke aminozuren op zulke specifieke locaties in membraaneiwitten dienen zowel structurele als functionele doeleinden. De lading van R347 is niet gekoppeld aan die van een ander residue in TMD1. Het ER-membraancomplex (EMC) is een geconserveerd eiwitcomplex, dat TMDs met geladen aminozuursequenties kan begeleiden als chaperonne in een nog niet precies begrepen mechanisme. Van het EMC werd eerder gerapporteerd dat het bindt aan CFTR hetgeen we konden bevestigen en uitdiepen in Hoofdstuk 6. Met de pulse-chase-methode gevolgd door limited proteolysis en immunoprecipitatie met de TMD-antilichamen, ontdekten we dat het EMC tijdens de synthese helpt bij het vouwen van TMD2, in een interactie die hoogstwaarschijnlijk gedreven wordt door ladings-krachten in de TM-gebieden van de twee eiwitten. Deze chaperonne functie is specifiek voor TMD2 en werd niet gezien voor de andere domeinen. Daarnaast voorkomt het EMC vroege afbraak van CFTR in het ER. In cellen zonder EMC werd post-translationele assemblage van CFTR verlaagd als gevolg van een gedestabiliseerd TMD2. Deze experimenten bieden direct inzicht in de rol van EMC bij het vouwen van TMDs die destabiliserende eigenschappen bevatten.

Een ander CFTR-chaperonne, Bap31 bevat net als EMC geladen TM-residuen en bindt aan CFTR vóór domein-assemblage. Bap31 werkt samen met TMD1 en sorteert CFTR naar de ER-geassocieerde afbraak route, maar de functie van Bap31 als chaperonne van CFTR-geladen residuen is niet onderzocht. In Hoofdstuk 7 laten we met behulp van de TMD-antistoffen zien dat de geladen residuen in de TMDs van Bap31 nodig zijn om de TMDs van CFTR post-translationeel te stabiliseren en dat Bap31-binding een efficiënte CFTR-domeinassemblage mogelijk maakt. We vermoeden daarom dat Bap31 CFTR helpt met vouwen door te voorkomen dat geladen residuen in de TMDs interacties aangaan met andere membraaneiwitten en daarmee fungeert als facilitator en kwaliteitscontrole voor CFTR-domeinassemblage.

Ten slotte worden in Hoofdstuk 8 de resultaten van de experimentele hoofdstukken in een bredere context besproken, met nadruk op de mogelijke selectiecriteria en bindings-mechanismen van EMC en Bap31. Verder correleren we het vouwings mechanisme van CFTR met andere type I ABC-transporters en stellen we een model voor hoe de twee chaperonnes werken bij het vouwen van CFTR. Dit model kan ook een nuttige beschrijving bieden voor het begrijpen van de vouwingsroutes van andere membraaneiwitten die zowel EMC als Bap31 gebruiken.