Marjon Kamp

The coordinated movement of cells towards a chemical substance (chemo-attractant) is
called chemotaxis. Chemotaxis is important for several processes within the human body,
including wound healing, embryonic development, and the immune response to infections.
However, chemotaxis is also involved in some diseases like metastasis of cancer cells, asthma
and Crohn’s disease. Because chemotaxis is involved in so many different things it is useful to
research this process to better understand it.
Research with human cells, like white blood cells, can be tricky because these cells are
only viable for a short time outside of the human body. On top of that it can be difficult to
introduce genetic modifications in human cells. Instead researchers often use the model
organism Dictyostelium discoideum to study chemotaxis. Dictyostelium is a unicellular
amoeba that lives in the soil where it eats bacteria. Whenever there is a shortage of food
Dictyostelium cells start to secrete a chemical called cyclic AMP (cAMP). cAMP functions as a
chemo-attractant, triggering surrounding amoeba to chemotax towards the source of cAMP.
Eventually the cells group together and form a multicellular structure with a stalk and a small
ball containing spores on top. These spores can be moved by the wind to a spot containing
more food, where single cells can start growing again. It is easy to grow Dictyostelium cells
in the laboratory using either petri-dishes or Erlenmeyer flasks containing medium. The
cells are haploid (they only contain one copy of each chromosome) which makes it easier
to generate genetic mutations. Importantly the way Dictyostelium cells move toward cAMP
is very similar to the way white blood cells move. Therefore, studying chemotaxis using the
model organism Dictyostelium can help us to understand the chemotaxis process in human
cells.
Chemo-attractants are detected on the outside of the cell by receptors, which are proteins
that protrude through the cell membrane. In a gradient there will be more receptors that bind
6 cAMP at the side of the high concentration, and thus more receptors will be activated on that
side of the cell. The gradient is translated to cell movement towards the chemo-attractant
by a signal transduction pathway inside the cell. You can divide this pathway into four steps:
1) The chemo-attractant (cAMP in the case of Dictyostelium) binds receptors on the outside
of the cell and activates them. 2) The receptor activation induces a structural change in the
part of the receptor that is on the inside of the cell, which results in the dissociation of
the coupled Gαβγ protein complex into Gα and Gβγ. When Gα and Gβγ are separated they
can activate other proteins, amongst which Guanidine Exchange Factors (GEFs). 3) GEFs
activate monomeric G proteins such as Ras, Rap and Rac. Activation occurs by exchanging
the nucleotide GDP for GTP in the monomeric G protein. There is a strong activation of these
monomeric G proteins at the front of and barely any activation at the back of the cell. 4)
These active monomeric G proteins trigger many other signal transduction pathways at the
front of the cell, which subsequently lead to changes in the cytoskeleton (the skeleton of the
cell). At the front of the cell the cytoskeleton part actin is elongated, leading to the formation
of pseudopods (protrusions of the cytoskeleton at the front of the cell). The remainder of the
cell is contracted and dragged along by a co-operative effort of the cytoskeleton parts actin
and myosin at the side and back of the cell.
Chapter 1 introduces chemotaxis in both human white blood cells and Dictyostelium. It

describes how chemotaxis receptors and heterotrimeric G proteins are regulated, based on
recent literature. The cell has mechanisms to adjust the sensitivity and number of chemotaxis
receptors. Heterotrimeric G proteins are regulated by three different type of enzymes; GEFs
(Guanidine Exchange Factors), RGS (Regulator of G proteins Signaling) and GDIs (Guanidine
Dissociation Inhibitors). GEFs activate heterotrimeric G proteins and extend their activity, RGS
inactivate and shorten the activity, while GDIs block activation of heterotrimeric G proteins.
The monomeric G proteins Ras, Rap and Rac are the first proteins in the chemotaxis signal
transduction pathway with a much stronger activation at the front of the cell. Oppositely, the
activation of the heterotrimeric G proteins Gα and Gβγ is directly proportional the steepness
of the gradient. It is not yet completely understood how the signal magnification at the front
of the cell is achieved. This is in part unclear because very few factors are known that can
bind and connect both heterotrimeric and monomeric G proteins. In chapter 2 a new protein
is described, Leucine Rich Repeat protein A (LrrA), which can bind both heterotrimeric and
monomeric G proteins. LrrA does not contain any enzymatic domains and has no preference
for binding to active or inactive G proteins (enzymes often have a preference). These findings
in combination with LrrA being able to bind simultaneously to Gα and Ras, strongly suggests
LrrA functions as a scaffold protein. When the LrrA gene is deleted in Dictyostelium many
things go wrong in the chemotaxis signal transduction pathway in the mutant. The mutant
shows less activation of heterotrimeric G proteins, while the activation of monomeric G
proteins Ras, Rap and Rac is elongated, and more actin filaments are produced in response
to cAMP. LrrA mutant cells can no longer form spores and chemotax less efficiently towards
cAMP. Together our results show that LrrA is a connector between heterotrimeric and
monomeric G proteins and is important for both spatial and temporal regulation of different
components of the chemotaxis signal transduction pathway.
The activation mechanism of Rap1, a monomeric G protein, is described in chapter
3. Rap1 plays a role in chemotaxis, but is also involved in cell adhesion and cell division
processes amongst others. We have identified two new Rap specific GEFs (GefL and GefQ)
and in chapter 3 we describe their role together with the known RapGEFs (GbpD and GflB). 6
GefQ and GbpD are primarily involved in activation of Rap1 during the growth phase (in
the presence of food), while GefL and GflB are important for starved cells. GefQ plays a
role in chemotaxis towards folic acid (chemotaxis towards bacteria). GbpD is important for
cell adhesion and is part of a positive feedback loop together with Rap1. GefL is important
for chemotaxis towards cAMP and for the development into spores. GflB is activated by
the heterotrimeric G protein Gα and plays a role in chemotaxis towards cAMP. Chapter 3
thus gives an overview on how the activation of the monomeric G protein Rap1 is regulated
throughout the development of Dictyostelium.
Chapter 4 focuses on regulation of the cytoskeleton, and in particular actin polymerization.
We show that actin filament formation in response to cAMP is partly dependent on
Rap1. Surprisingly we also found that actin has an inhibitory effect on Rap1 activation. As
mentioned above Rap1 is part of a positive feedback loop: Rap1 activates the enzyme PIPK,
PIPK produces the lipid PIPP, PIPP activates the GEF GbpD and GbpD activates Rap1. This
loop functions as a driving force for Rap1 activation, resulting in an increasing amount of
active Rap1. However, Rap1 also induces actin, and actin functions as a break on this positive
feedback loop. Therefore, too much activation of Rap1 will automatically lead to an inhibition
on Rap1 activation.

Chapter 5 summarizes all the results and puts them in a wider context. My thesis
demonstrates that chemotaxis is strongly regulated at all levels of the signal transduction
pathway. Both the timing of activation and the localization of proteins is regulated. The many
layers of regulation result in a robust but flexible system that functions in both low and high
concentrations of chemo-attractant. It can be difficult to interpret data in this system because
of the many layers of regulation and different feedback loops. However, by asking clear
question and by carefully considering experimental set-ups one can gain more knowledge on
chemotaxis. By comparing the chemotaxis data from Dictyostelium to mammalian cells we
can create a general model on how chemotaxis works.

folate cAMP
expression level
fAR1 cAR1 receptor a nity
GEFs
Gα4 Gβγ Gα2 Gβγ RGS
GDIs
LrrA

Ras Ras Rac

GefQ G B GefL

PIPK
6 Rap1 GbpD PIPP

IQGAPN
actin
A schematic
of the different parts of the chemotaxis pathway in Dictyostelium discussed
within this thesis. In green the regulation of the chemotaxis receptors and heterotrimeric G proteins
reviewed in chapter 1. In pink the scaffold protein LrrA connected to its interaction partners by lines,
discussed in detail in chapter 2. In blue all four Rap1 GEFs, three of which have been investigated
in chapter 3. In yellow the Rap1 amplification loop involving Rap1, PIPK, PIPP and GbpD, and the
IQGAPN dependent inhibition of this loop by actin described in chapter 4. Solid lines represent direct
interactions while dotted lines represent indirect interactions.

De gecoördineerde beweging van cellen richting een chemische stof (chemo-attractant)
wordt ook wel chemotaxis genoemd. Chemotaxis is belangrijk voor meerdere lichamelijke
processen, zoals wondgenezing, embryonale ontwikkeling en immuunreacties op infecties.
Maar chemotaxis speelt ook een rol bij sommige ziektes, zoals het uitzaaien van kankercellen,
astma en de ziekte van Crohn. Omdat chemotaxis een rol speelt in zoveel verschillende
processen is het nuttig om dit proces te onderzoeken en beter te begrijpen.
Onderzoek met menselijke cellen, zoals witte bloedcellen, kan lastig zijn omdat deze
cellen niet lang in leven blijven buiten het lichaam. Bovendien is het lastig om op DNA-niveau
veranderingen aan te brengen in deze cellen. In plaats daarvan wordt er veel gebruik gemaakt
van het modelorganisme Dictyostelium discoïdeum. Dit is een eencellige amoebe die in de
grond leeft en daar bacteriën eet. Wanneer er te weinig voedsel is voor de amoebe begint hij
een stof af te scheiden genaamd cyclisch AMP (cAMP). cAMP werkt als een chemo-attractant
waardoor omliggende amoeben op de stof afkomen door middel van chemotaxis. Uiteindelijk
komen de cellen samen en vormen een multicellulaire structuur met een steel en bovenop
een bolletje met sporen. Deze sporen kunnen meegenomen worden door de wind en op een
andere plek met meer voedsel weer verder groeien. In het laboratorium zijn Dictyostelium
cellen makkelijk te groeien in petri-schaaltjes of in een erlenmeyer met medium. Daarnaast
zijn de cellen haploïd (ze hebben maar één exemplaar van ieder chromosoom) waardoor
het makkelijker is om genetische veranderingen aan te brengen. De manier waarop de
Dictyostelium cellen richting de stof cAMP bewegen lijkt bovendien sterk op de manier hoe
witte bloedcellen zich bewegen. Onderzoek naar chemotaxis in Dictyostelium cellen kan
daarom helpen bij het begrijpen van chemotaxis in menselijke cellen.
Het chemo-attractant wordt aan de buitenkant van de cel gedetecteerd door receptoren,
dit zijn eiwitten die door de wand van de cel steken. In een gradiënt zullen aan de kant van de
hoge concentratie meer receptoren cAMP binden, en meer receptoren geactiveerd worden.
Via een signaaltransductiepad aan de binnenkant van de cel wordt deze gradiënt omgezet 6
tot beweging van de cel richting de stof. Dit pad kan je grofweg indelen in 4 stappen: 1)
De chemo-attractant (cAMP in het geval van Dictyostelium) bindt aan receptoren aan de
buitenkant van het celmembraan en activeert deze. De activatie van de receptor zorgt voor
een vormverandering van de receptor aan de binnenkant van de cel. 2) Door deze vorm-
verandering raakt het gekoppelde heterotrimere G-eiwitcomplex Gαβγ los van de receptor
en splitst zich in Gα en Gβγ. Wanneer Gα en Gβγ los zijn van de receptor kunnen ze andere
eiwitten activeren, waaronder Guanidine uitwisselings factoren (GEFs). 3) Monomere
G-eiwitten zoals Ras, Rap en Rac worden geactiveerd door GEFs. Activatie gebeurt door
het verwisselen van de nucleotide groep GDP met GTP in het monomere G-eiwit. Deze
monomere G-eiwitten worden aan de voorkant van de cel sterk geactiveerd maar niet aan
de achterkant. De monomere G-eiwitten zorgen voor de activatie van veel andere transduc-
tiepaden aan de voorkant van de cel. 4) De verschillende paden leiden tot veranderingen in
het cytoskelet (het skelet van de cel). Aan de voorkant wordt het cytoskelet-onderdeel actine
verlengd, dit leidt tot vorming van pseudopoden, uitstulpingen aan de voorkant van de cel.
De rest van de cel wordt samengetrokken en meegetrokken door een samenwerking tussen
de cytoskelet-onderdelen actine en myosine aan de zij- en achterkant van de cel.

Hoofdstuk 1 geeft een inleiding over chemotaxis in zowel menselijke witte bloedcellen
als in Dictyostelium. Het beschrijft hoe chemotaxis-receptoren en heterotrimere G-eiwitten
gereguleerd worden, gebaseerd op recente literatuur. De cel heeft mechanismen om de
hoeveelheid en de gevoeligheid van receptoren op de cel aan te passen. De heterotrimere
G-eiwitten worden gereguleerd door een drietal enzymen, de GEFs (Guanidine uitwisselings
factoren), RGS (regulator of G protein signaling) en GDIs (guanine nucleotide dissociatie
remmers). De GEFs activeren heterotrimere G-eiwitten en verlengen de activiteit, RGS
inactiveren en verkorten de activiteit, terwijl GDIs de activatie blokkeren.
De monomere G-eiwiten Ras, Rap en Rac zijn de eerste eiwitten in het chemotaxis
transductiepad die een veel sterkere activatie aan de voorkant van de cel hebben. In
tegenstelling is de activatie van heterotrimere G-eiwitten Gα en Gβγ recht evenredig met
de sterkte van de gradiënt. Het is nog niet compleet bekend hoe de versterking van het
signaal aan de voorkant van de cel wordt bereikt. Dit komt onder andere omdat er nog maar
weinig factoren bekend zijn die zowel de heterotrimere als monomere G-eiwitten binden. In
hoofdstuk 2 wordt een nieuw eiwit beschreven, Leucine Rich Repeat eiwit A (LrrA), dat aan
zowel heterotrimere als monomere G-eiwitten kan binden. We denken dat dit eiwit werkt als
een soort steiger-eiwit die meerdere eiwitten bindt en samenbrengt. Dit vermoeden wordt
onderbouwd omdat LrrA geen enzymatische domeinen bevat, LrrA geen voorkeur heeft
voor de actieve of inactieve vorm van G-eiwitten (enzymen hebben vaak een voorkeur), en
doordat Gα en Ras tegelijkertijd lijken te kunnen binden. Wanneer het LrrA gen verwijderd
wordt uit Dictyostelium cellen gaan er allerlei dingen in het chemotaxis signaaltransductie-
pad fout in de mutant. Er is minder activatie van heterotrimere G-eiwitten, terwijl de activatie
van monomere G-eiwitten Ras, Rap en Rac langer duurt, daarnaast worden er minder actine
draden gevormd na toevoeging van cAMP aan de mutant. Bovendien kunnen deze cellen
niet langer sporen vormen en is chemotaxis minder efficiënt. LrrA verbindt heterotrimere
en monomere G-eiwitten, en is belangrijk voor de timing en lokalisatie van verschillende
6 componenten in het signaaltransductiepad.
De activatie van Rap1, een monomeer G-eiwit, wordt beschreven in hoofdstuk 3. Rap1
speelt een rol in chemotaxis, maar is ook belangrijk voor onder andere celadhesie en
celdeling. In hoofdstuk 3 worden twee nieuwe GEFs geïntroduceerd (GefL en GefQ), naast
twee GEFs die al bekend waren (GbpD en GflB), welke allemaal Rap1 kunnen activeren.
GefQ en GbpD spelen vooral een rol bij de activatie van Rap1 voordat cellen gehongerd
worden, terwijl GefL en GflB belangrijk zijn in gehongerde cellen. GefQ speelt een rol in
chemotaxis naar foliumzuur (chemotaxis naar bacteriën). GbpD is belangrijk voor celadhesie,
en zit in een zelfversterkende lus met Rap1. GefL is belangrijk voor chemotaxis naar cAMP en
voor de ontwikkeling van Dictyostelium cellen tot sporen. GflB wordt geactiveerd door het
heterotrimere G-eiwit Gα en speelt een rol in chemotaxis naar cAMP. Hoofdstuk 3 geeft een
overzicht hoe de activatie van het monomere G-eiwit Rap1 gereguleerd wordt gedurende de
ontwikkeling van Dictyostelium.
In hoofdstuk 4 ligt de focus op het cytoskelet, en met name actine. Allereerst beschrijft
het dat de cel actine aanmaakt als het in aanraking komt met cAMP, en dat dit gedeeltelijk
afhankelijk is van Rap1. Maar verassend genoeg hebben we hier ontdekt dat actine een
remmende werking heeft op Rap1 activatie. Zoals hierboven gemeld bevindt Rap1 zich in
een zelfversterkende lus: Rap1 activeert het enzym PIPK, PIPK maakt het lipide PIPP, PIPP

activeert de GEF GbpD en GbpD activeert Rap1. Deze lus werkt als een soort vliegwiel voor
Rap1 activatie, waardoor steeds meer Rap1 actief wordt. Maar Rap1 activeert ook actine en
actine werkt als een rem op dit vliegwiel. Dus te veel Rap1 activatie leidt automatisch tot een
remming van Rap1 activatie.
In hoofdstuk 5 worden alle resultaten nogmaals samengevat, en in een bredere context
geplaatst. In z’n geheel laat mijn thesis duidelijk zien dat chemotaxis sterk gereguleerd wordt
op alle niveaus van het signaaltransductiepad. De timing van activatie en lokalisatie van
eiwitten wordt gereguleerd. Door de vele lagen van regulatie ontstaat een robuust, maar
ook flexibel systeem dat werkt in zowel hoge als lage concentraties van chemo-attractant.
Door de vele lagen van regulatie, en door meerdere lussen in het transductiepad is het soms
lastig om data te interpreteren. Maar door duidelijke vragen te stellen, en door eerst goed
na te denken over hoe je een experiment opzet kunnen we nog steeds meer informatie
verkrijgen over chemotaxis. Door de informatie verkregen met Dictyostelium te vergelijken
met chemotaxis in zoogdiercellen ontstaat een algemeen beeld hoe chemotaxis werkt.

folate cAMP
expressie niveau
fAR1 cAR1 receptor a niteit
GEFs
Gα4 Gβγ Gα2 Gβγ RGS
GDIs
LrrA

Ras Ras Rac

GefQ G B GefL
PIPK

Rap1 PIPP
GbpD

IQGAPN
actine
Een schematisch overzicht van de verschillende onderdelen van het chemotaxis signaaltransductiepad
in Dictyostelium beschreven in dit proefschrift. In groen de regulatie van de chemotaxis receptoren
en heterotrimere G-eiwitten beschreven in hoofdstuk 1. In roze het steiger-eiwit LrrA dat via lijnen is
verbonden met zijn interactiepartners, beschreven in hoofdstuk 2. In blauw de vier Rap1 GEFs, waarvan
er drie zijn onderzocht en beschreven in hoofdstuk 3. In geel de zelfversterkende lus bestaande uit
Rap1, PIPK, PIPP en GbpD, en de actine-gemedieerde remming van deze lus via IQGAPN, welke zijn
beschreven in hoofdstuk 4. De ononderbroken lijnen staan voor directe interacties en de onderbroken
lijnen geven indirecte interacties aan.