Mariska Van Lier

During brain development, neuronal networks are still dynamic and being shaped. The brain must be able adapt to sensory stimuli. Especially after birth and in childhood, there are various critical periods in which a neuronal network adapts to external experiences. There are critical periods for correct processing of sensory perceptions such as seeing with both eyes, developing motor skills and learning a first language. These skills must be learned during a specific critical period in order to optimize relevant neuronal networks. Once a critical period is closed, neuronal networks are less dynamic and it becomes more difficult or even impossible to learn certain new skills. The opening and closing of critical periods must therefore be carefully regulated. If the timing of critical periods are altered, developmental disorders can arise with cognitive, behavioral and motor problems. In this dissertation we have investigated various mechanisms that regulate critical periods.

The model we used to investigate critical periods is the visual system of the mouse. During development, the visual system must learn to process information from both eyes to form one image. If one eye is temporarily deprived during a critical period, cells in the visual cortex will react less to this eye and ultimately more to the other eye. This is due to structural and functional changes of neuronal connections and this form of plasticity is called ocular dominance (OD) plasticity. The critical period for OD plasticity occurs in mice between approximately P20 (20 days after birth) and P35 with a peak around P28. After this period, the amount of OD plasticity is greatly reduced.

Critical periods are regulated by various mechanisms. One of the mechanisms that play a role in closing the critical period is the stabilization of axons and synapses. During the critical period for OD plasticity there is a lot of growth and retraction of axons. These axonal changes are greatly reduced after closure of the critical period. In addition, a great deal of synaptic plasticity occurs during the critical period. After critical period closure, there is still local synaptic plasticity, but much less. Another mechanism is inhibition via the neurotransmitter γ-amino butyric acid (GABA), which plays a crucial role in regulation of critical periods. Too much inhibition can lead to early opening and closing of critical periods and a lack of inhibition can cause a delayed or late critical period. This has been extensively studied in animal models where the amount of inhibition is genetically or pharmacologically manipulated. A shift in the excitation / inhibition balance is also the basis for development disorders in which critical periods are disrupted, such as Rett syndrome and Fragile X syndrome.

In this dissertation we looked at both mechanisms involved in the regulation of critical periods. In chapter 2 we looked at structural aspects and found that genes involved in regulation of Wallerian degeneration, a form of axonal degeneration that normally occurs after damage to axons, are also involved in plasticity during critical periods. In chapters 3 and 4 we have shown that increased inhibition in a mouse model for the developmental disorder Neurofibromatosis type 1 (NF1) can lead to an early closure of the critical period for OD plasticity.

Wallerian degeneration is a form of degeneration in which axons immediately disintegrate after losing contact with the cell body. This process is regulated by the nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase (NMNATs) enzymes in the cytoplasm. In a mouse model that produces the fusion protein UBE4b-NMNAT1 due to a mutation (WldS mice), Wallerian degeneration is delayed. This type of degeneration is also delayed in mice overexpressing NMNAT1 into the cytoplasm. In a study analyzing proteins involved in cortical development and OD plasticity, some proteins were found which are also involved in Wallerian degeneration. That is why in chapter 2 we investigated whether OD plasticity has changed in mice in which Wallerian degeneration is delayed. We found that both WldS mice and mice overexpressing NMNAT1 have reduced OD plasticity at the end of the critical period. We also observed that WldS mice have an accelerated development of visual acuity, a development process that runs parallel to the critical period for OD plasticity. Despite that we showed that the NMNAT signaling pathway is involved in OD plasticity, we did not find any evidence that Wallerian degeneration actually occurs during this type of plasticity. It is possible that NMNATs not only regulate Wallerian degeneration after damage, but that they also play an important role in the regulation of critical periods during normal cortical development.

In addition to structural changes, inhibition also plays a major role in regulation of critical periods. In a mouse model for the developmental disorder NF1 (nf1+/- mice), GABAergic inhibition is increased in distinct parts of the brain. NF1 is a developmental disorder that is associated with cognitive, motor and behavioral problems. In addition, patients often suffer from skin problems, disfiguration and an increased risk of tumors. NF1 is caused by a mutation in the nf1 gene leading to reduced expression of the protein neurofibromin. There is no therapy other than controlling symptoms. Elevated GABAergic inhibition seems to underlie the cognitive problems in NF1. Since increased inhibition may affect the opening and closing of critical periods, we examined the development of inhibition in the visual cortex and whether the timing of the critical period for OD plasticity has changed.

In chapter 3 we studied the development of the cerebral cortex in nf1+/- mice. We first investigated how GABAergic inhibition and the activity of pyramidal cells in the visual cortex develop. After eye opening, the activity of pyramidal cells increased rapidly. The excitability of these neurons also slightly increased in nf1+/- mice. After eye opening, the amount of GABAergic inhibition should slowly increase, but it increases rapidly in nf1+/- mice. The disturbed balance between excitation and inhibition can influence spontaneous activity during the early development of the cerebral cortex. This spontaneous activity is generated in the retina or in the cerebral cortex and spreads throughout cortical areas of the brain. This is important for the establishment of proper neuronal connections. In the visual system, for example, this is important for establishment of optimal connections between the retina, thalamus and the visual cortex. Therefore, we investigated the development of spontaneous cortical activity. However, we detected no difference in spontaneous activity in the visual cortex between nf1+/- mice and their wild-type controls. Therefore, it appears that the cognitive problems in NF1 develop at a later stage.

Chapter 4 is a continuation of the study in chapter 3 and investigates cortical development of one month old nf1+/- mice. We studied the activity of GABAergic interneurons and pyramidal cells in the visual cortex of nf1+/- mice during the critical period for OD plasticity. We show that cortical inhibition remains elevated and that the excitability of pyramidal cells is normal at that age. Importantly, we showed that the critical period for OD plasticity closes early in nf1+/- mice. During the normal peak of the critical period (P28), nf1+/- mice exhibit much less OD plasticity compared to wild-type mice, whereas one week earlier in development the amount of plasticity is normal. It is also interesting that the critical period for OD plasticity starts normally and that the total duration of the critical period for OD plasticity is therefore shortened in these animals. This can have major consequences later in life, because there is less time to optimize the neuronal networks. Proper regulation of critical periods is also important because these critical periods succeed each other. Plasticity often occurs in lower cortical areas first, followed by critical periods in higher, more specialized cortical areas. If this is not properly coordinated, this can result in cognitive, motor and behavioral problems, such as in patients with NF1.

Because cognitive problems in NF1 are mainly caused by increased GABAergic inhibition, most clinical studies focus on (pharmacologically) reducing inhibition. So far, these clinical studies have not been successful. It is possible that the timing of the treatments are not correct and that they start after the closure of critical periods. Additionally, the time at which inhibition should be reduced and the required dose could differ depending on brain areas. It will be challenging to reduce the amount of inhibition at different moments in different brain areas. Another approach is extending the critical period and rescuing the early closure. In mice, critical periods can be extended by environmental enrichment, which reduces the amount of inhibition. We showed that by raising nf1+/- mice in an enriched environment, the differences in GABAergic inhibition and OD plasticity disappeared. This means that enriching the environment can prevent developmental problems.

In this dissertation we have shown that timing and regulation of critical periods are very important. We have unraveled a structural aspect of the closure of critical periods and looked at the role of inhibition in the regulation of critical periods. We have found that cytoplasmic NMNATs play a role in OD plasticity. Previously it was not known that these proteins play a role in normal development, and were considered to be only involved after neuronal injury. In addition, we have demonstrated that increased inhibition results in early closure of critical periods in nf1+/- mice and that this can be saved by rearing these mice in an enriched environment. Because of these findings, we now know more about the mechanisms that regulate critical periods. This creates new opportunities for treatment strategies or for development of new therapeutic approaches.

Tijdens de ontwikkeling van onze hersenen worden er vele neuronale netwerken aangelegd die dan nog heel dynamisch zijn. Het brein moet in staat zijn nieuwe informatie op te nemen en zich aan te passen. Vooral na de geboorte en in de kinderjaren zijn er verschillende kritische perioden waarin een neuronaal netwerk zich aanpast door ervaringen van buitenaf. Er zijn kritische perioden voor het correct verwerken van zintuigelijke waarnemingen zoals het zien met beide ogen, het ontwikkelen van motorische vaardigheden en het leren van een eerste taal. Deze vaardigheden moeten tijdens een specifieke kritische periode geleerd worden zodat desbetreffende neuronale netwerken geoptimaliseerd worden. Als een kritische periode eenmaal gesloten is zijn de betrokken neuronale netwerken minder dynamisch en wordt het lastig tot onmogelijk om bepaalde vaardigheden alsnog te leren. Het openen en sluiten van kritische perioden moet daarom nauwkeurig gereguleerd worden. Als dit niet goed gaat kunnen er ontwikkelingsstoornissen ontstaan met cognitieve, gedrags- en motorische problemen. In dit proefschrift hebben wij verschillende mechanismen onderzocht die kritische perioden reguleren.

Het model dat wij gebruikt hebben om kritische perioden te onderzoeken is het visuele systeem van de muis. Tijdens de ontwikkeling moet het visuele systeem leren om informatie van beide ogen te verwerken en één beeld te vormen. Wanneer tijdens een kritische periode één oog tijdelijk gedepriveerd wordt zullen cellen in de visuele hersenschors minder op dit oog gaan reageren en uiteindelijk meer op het andere oog. Dit komt door structurele en functionele veranderingen van neuronale verbindingen. Deze vorm van plasticiteit wordt oculaire dominantie (OD) plasticiteit genoemd. De kritische periode voor OD plasticiteit vindt bij muizen plaats tussen ongeveer P20 (20 dagen na de geboorte) en P35 met een piek rond P28. Na deze periode is OD plasticiteit veel minder sterk.

Kritische perioden worden op verschillende manieren gereguleerd. Eén van de mechanismen die een rol spelen in het sluiten van de kritische periode is het stabiliseren van axonen en synapsen. Tijdens de kritische periode voor OD plasticiteit vindt er veel groei en terugtrekking van axonen plaats. Dit is na het sluiten van de kritische periode veel minder. Daarnaast vindt er tijdens de kritische periode ook in grote mate synaptische plasticiteit plaats. Na het sluiten is er nog wel lokale synaptische plasticiteit, maar veel minder. Een ander mechanisme is dat inhibitie via de neurotransmitter γ-amino butyric acid (GABA) een cruciale rol speelt in de regulatie van kritische perioden. Teveel inhibitie kan zorgen voor het vroeg openen en sluiten van kritische perioden en een tekort aan inhibitie kan juist zorgen voor een vertraagde of late kritische periode. Dit is veel onderzocht in diermodellen waarbij de hoeveelheid inhibitie genetisch of farmacologisch gemanipuleerd wordt. Een verschuiving van de excitatie/inhibitie balans ligt ook ten grondslag aan ontwikkelingsstoornissen waarin kritische perioden verstoord zijn, zoals Rett syndroom en het fragile X syndroom.

In dit proefschrift hebben wij naar beide mechanismen gekeken die betrokken zijn bij de regulatie van kritische perioden. In hoofdstuk 2 hebben wij naar structurele aspecten gekeken en gevonden dat genen die betrokken zijn bij de regulatie van Walleriaanse degeneratie, een vorm van axonale degeneratie dat normaal optreedt na schade aan axonen, ook betrokken zijn bij plasticiteit tijdens de kritische perioden. In hoofdstukken 3 en 4 hebben wij laten zien dat verhoogde inhibitie in een muismodel voor de ontwikkelingsstoornis Neurofibromatose type 1 (NF1) kan leiden tot een vervroegde sluiting van de kritische periode voor OD plasticiteit.

Walleriaanse degeneratie is een vorm van degeneratie waarin axonen acuut desintegreren nadat ze contact met het cellichaam hebben verloren. Dit proces wordt gereguleerd door de enzymen nicotinamide mononucleotide adenylyltransferases (NMNATs) in het cytoplasma. In een muizensoort dat door een mutatie een fusie eiwit UBE4b-NMNAT1 produceert (WldS muizen) is Walleriaanse degeneratie erg vertraagd. Dit type degeneratie wordt ook vertraagd als in muizen NMNAT1 in het cytoplasma tot overexpressie wordt gebracht. In een studie waarin gekeken is welke eiwitten er veranderen tijdens OD plasticiteit kwamen er ook enkele eiwitten naar voren die betrokken zijn bij Walleriaanse degeneratie. Daarom zijn wij in hoofdstuk 2 gaan kijken of OD plasticiteit veranderd is in muizen in welke Walleriaanse degeneratie vertraagd is. Dit blijkt inderdaad zo te zijn. Zowel WldS muizen als muizen die NMNAT1 tot overexpressie brengen hebben verminderde OD plasticiteit aan het einde van de kritische periode. Wij zagen ook dat WldS muizen een versnelde ontwikkeling hebben van visuele acuïteit, een ontwikkelingsproces om scherpte te kunnen zien. De ontwikkeling van visuele acuïteit is een proces dat parallel loopt aan de kritische periode voor OD plasticiteit. Ondanks dat wij hebben aangetoond dat de NMNAT signaal cascade een rol speelt bij OD plasticiteit, we hebben geen bewijs kunnen vinden dat Walleriaanse degeneratie dan ook daadwerkelijk optreedt. Het is goed mogelijk dat NMNATs niet alleen Walleriaanse degeneratie reguleren na schade, maar dat ze ook een belangrijke rol hebben in de regulatie van kritische perioden tijdens normale corticale ontwikkeling.

Behalve structurele veranderingen speelt ook inhibitie een grote rol bij de regulatie van kritische perioden. In een muismodel voor de ontwikkelingsstoornis NF1 (nf1+/- muizen) is GABAerge inhibitie verhoogd in verschillende hersendelen. NF1 is een ontwikkelingsstoornis dat gepaard gaat met cognitieve, motorische en gedragsproblemen. Daarnaast hebben patiënten veelal last van huidproblemen, disfiguratie en een verhoogde kans op tumoren. NF1 wordt veroorzaakt door een mutatie in het nf1 gen wat leidt tot verminderde expressie van het eiwit neurofibromine. Behalve symptoombestrijding is er geen therapie. De cognitieve problemen lijken door verhoogde GABAerge inhibitie te komen. Omdat verhoogde inhibitie de opening en sluiting van kritische perioden kan beïnvloeden hebben wij gekeken hoe inhibitie in de visuele hersenschors zich ontwikkelt en of de kritische periode voor OD plasticiteit veranderd is.

In hoofdstuk 3 hebben wij gekeken hoe de ontwikkeling van de hersenschors verloopt in nf1+/- muizen. Eerst hebben wij onderzocht hoe GABAerge inhibitie en de activiteit van piramidale cellen in de visuele schors zich ontwikkelen. Nadat bij muizen de ogen open gaan gaat de activiteit van piramidale cellen snel omhoog. Bij nf1+/- muizen is ook de prikkelbaarheid van deze neuronen iets verhoogd en zullen ze zelf sneller actiepotentialen afgeven. De GABAerge inhibitie die deze cellen krijgen hoort dan rustig omhoog te gaan, maar deze schiet bij nf1+/- muizen omhoog. Omdat de verstoorde balans tussen excitatie en inhibitie invloed kan hebben op spontane activiteit tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenschors hebben wij dit ook onderzocht. Deze spontane activiteit wordt gegenereerd in de retina of in de hersenschors zelf en verspreid zich door het brein. Dit is belangrijk voor de aanleg van neuronale connecties. In het visuele systeem is dit bijvoorbeeld belangrijk voor goede connecties tussen de retina, thalamus en de visuele hersenschors. Wij hebben echter geen verschil gevonden in spontane activiteit in de visuele schors tussen nf1+/- muizen en hun wild-type controles. Het lijkt er daarom op dat de ontwikkelingsproblemen bij NF1 zich pas later ontwikkelen.

Hoofdstuk 4 is een vervolg op hoofdstuk 3 en gaat over de studie van nf1+/- muizen van één maand oud. Eerst hebben wij gekeken naar de activiteit van GABAerge interneuronen en piramidale cellen in de visuele hersenschors van nf1+/- muizen tijdens de kritische periode voor OD plasticiteit. Wij laten zien dat corticale inhibitie verhoogd blijft en dat de verhoogde prikkelbaarheid van piramidale cellen die wij in hoofdstuk 3 vonden, dan hersteld is. Het is heel belangrijk is dat wij laten zien dat de kritische periode voor OD plasticiteit vroeg sluit in nf1+/- muizen. Tijdens de normale piek van de kritische periode (P28) vertonen nf1+/- muizen veel minder OD plasticiteit vergeleken met wild-type muizen, terwijl dit een week eerder in de ontwikkeling normaal is. Interessant is ook dat deze kritische periode wel normaal start en dat de totale duur van de kritische periode voor OD plasticiteit dus verkort is in deze dieren. Dit kan grote gevolgen hebben omdat er minder tijd is om de neuronale netwerken te optimaliseren. Ook is de regulatie van kritische perioden belangrijk omdat deze elkaar opvolgen. Plasticiteit vindt vaak eerst plaats in lagere corticale gebieden en daarna pas in hogere, meer gespecialiseerde corticale gebieden. Als dit elkaar niet goed opvolgt kan dit leiden tot cognitieve, motorische en gedragsproblemen zoals in patiënten met NF1.

Omdat cognitieve problemen bij NF1 voornamelijk veroorzaakt worden door verhoogde GABAerge inhibitie richten de meeste klinische studies zich op het (farmacologisch) verminderen van deze inhibitie. Tot nu toe zijn deze klinische studies echter nog niet succesvol. Het is goed mogelijk dat de timing van de behandelingen niet goed is en dat de behandelingen pas na het sluiten van kritische perioden worden gestart. Ook kunnen de momenten van behandeling en de dosering erg afhankelijk zijn van verschillende hersengebieden. Het is dan ook een uitdaging om de hoeveelheid inhibitie op verschillende momenten te verlagen, afhankelijk van het hersengebied. Een andere mogelijkheid is om kritische perioden te verlengen. In muizen kunnen kritische perioden verlengd worden door kooiverrijking. Doordat kooiverrijking de hoeveelheid inhibitie verlaagt kan de kritische periode voor OD plasticiteit verlengd worden. Wij hebben laten zien dat door nf1+/- muizen op te laten groeien in een verrijkte omgeving, de verschillen in GABAerge inhibitie en in OD plasticiteit verdwenen zijn. Dit betekent dat verrijking van de omgeving ontwikkelingsproblemen kan overwinnen.

In dit proefschrift hebben wij laten zien dat de timing en regulatie van kritische perioden erg belangrijk zijn. Wij hebben een structureel aspect van de sluiting van kritische perioden ontrafeld en gekeken naar de rol van inhibitie in de regulatie van kritische perioden. Wij hebben gevonden dat NMNATs in het cytoplasma een rol spelen bij OD plasticiteit. Voorheen was het niet bekend dat deze eiwitten een rol hebben in normale ontwikkeling, alleen bij schade. Daarnaast hebben wij aangetoond dat verhoogde inhibitie resulteert in vervroegde sluiting van kritische perioden in NF1 en dat dit tegengegaan kan worden door verrijking van de omgeving. Door deze bevindingen weten wij meer over de mechanismen die de kritische perioden reguleren. Dit kan nieuwe aanknopingspunten opleveren voor behandelstrategieën of voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.