Jorge Armero Gimenez

Human history is tightly connected to our interaction with other organisms, most notably pathogens. Ever-present diseases such as polio and cholera, or epidemic and pandemic agents such as Yersinia pestis and influenza viruses have had a great impact on the quality of human life and how our societies developed. The combined scientific efforts over several centuries have led to the development of numerous methods to combat these pathogenic agents, with vaccines proving to be the most effective. A wide diversity of vaccine types exists nowadays, each having their advantages and shortcomings. Among them, virus-like particles (VLPs) represent a very promising vaccination platform, given their high immunogenicity and safety. However, methods for expedited VLP vaccine development and manufacture are required in the event of a novel epidemic or pandemic threat (e.g. SARS-CoV-2).

Current cell-based platforms for VLP manufacture show limitations in key areas critical for pandemic preparedness, including high-throughput candidate screening, scalability, speed, and flexibility. For this reason, in this thesis we investigated the use of a novel BY-2 tobacco-based cell-free protein synthesis (CFPS) system (BYL, commercialized as ALiCE®) as a tool for pandemic preparedness. In Chapter 2, we investigated the use of BYL to quickly screen different chimeric variants of a hepatitis B core (HBc) virus-like particle (VLP). The open reaction conditions of BYL enabled the expedited expression and assembly analysis of different HBc-based chimeric VLPs. We observed that the inclusion of the C-terminal domain (CTD) of the HBc VLP increased particle stability, at the expense of lower acceptability of foreign inserts at the major immunomodulatory region. The scalability of HBc VLP production in BYL was also tested, showing linear scale-up to 1L without losses in protein yield. Produced VLPs were promptly recognized and internalized by immature dendritic cells and triggered a pro-inflammatory response when exposed to human peripheral blood mononuclear cells. These results thus indicate the applicability of BYL-produced HBc VLPs as vaccines.

In vaccine manufacture, the establishment of efficient and scalable purification processes is a mandatory step to generate cost-effective vaccine candidates. In Chapter 3 we studied the application of different workflows for the purification of HBc VLP-based vaccines produced in BYL. Hydrophobic interaction, rather than ion exchange chromatography, was shown as an efficient method to purify HBc VLPs, reflecting on the intrinsic hydrophobicity of the HBc particles. The previously used heat-treatment clarification step was effectively replaced by a more scalable multimodal chromatography process. Lastly, the affinity-based purification of HBc VLPs under denaturing conditions allowed the purification of HBc VLPs carrying non-canonical amino acids which altered their purification properties. These results thus show the drastic effects that small insertions can have on multimeric protein structures regarding their interaction with chemical groups used for purification. The development of these purification methods also highlighted key characteristics that need to be addressed when purifying proteins from BYL, including the presence of large nucleic acid molecules and phenolic compounds.

The introduction of non-canonical amino acids (ncaas) can be utilized to further enhance the flexibility of VLP-based vaccines. Ncaas consist of amino acids carrying active chemical groups that provide added functionalities to the proteins in which they are incorporated. By incorporating reactive orthogonal handles to a VLP and its conjugation partner (e.g. a complex antigen), a post-assembly conjugation reaction can be performed. The post-assembly conjugation to VLPs thus allows their modification with complex antigenic structures that would not have been possible via protein fusion. In Chapter 4, we investigated ncaa incorporation in BYL to introduce orthogonal reactive conjugation handles into the HBc VLP and the receptor binding domain (RBD) from influenza hemagglutinin. For that purpose, different amber suppression systems were tested, from which the Escherichia coli tyrosine transferase showed the highest ncaa incorporation yields. The pyrrolysine amber suppression systems from Methanosarcina mazei and Methanosarcina barkeri showed very low ncaa incorporation yields, even when the transferase was exogenously produced and supplemented to BYL reactions. Click-mediated conjugation of ncaa-modified RBD to HBc VLPs produced in BYL resulted in fully formed, structurally sound HBc VLPs with active influenza RBDs on the surface.

In vaccine development, the possibility to test and produce different vaccine candidates in parallel is of great importance. Notably, high-throughput screening (HTS) of different vaccine candidates can expedite development during a pandemic, especially when there is no available information on the viability, structure, immunogenicity, or producibility of antigens from the pathogen for vaccination. In Chapter 5, the applicability of BYL for HTS was further studied. We analysed the application of different genetic templates for expression in BYL to enable the utilization of faster in vitro genetic construct designs. This showed that the utilization of protection against exonucleases was mandatory for expression in BYL. Linear DNA templates showed overall lower yields than plasmids, possibly due to lower transcription yields and/or RNA stability. Additionally, we developed a novel circularization strategy that makes use of a cycling reaction and a thermostable ligase, which rapidly generated templates for BYL expression that do not show a reduction in yield. Lastly, studies into T7 activity and transcription within BYL were performed that show that pyrophosphatase activity is not a key factor affecting BYL yield. These results will help optimize expression when using alternative DNA templates in BYL and thus in its application for HTS.

Altogether, this thesis shows the potential of the BYL CFPS system for the screening and scaled manufacture of VLP-based vaccines. The utilization of the HBc VLP, together with the incorporation of ncaa and high-throughput screening sets the groundwork required to apply BYL as a pandemic preparedness platform for expedited candidate vaccine development.

Resumen

La historia de la humanidad está profundamente interconectada con nuestra interacción con diversos organismos, especialmente los microorganismos patógenos. Entre enfermedades que nos han acompañado prácticamente desde los anales de la historia, como la viruela o el cólera, y brotes epidémicos o pandémicos como la peste negra y la gripe, el impacto de los patógenos en la calidad de vida y en el desarrollo de nuestra sociedad ha sido muy marcado. A lo largo de varios siglos, grandes avances en la ciencia y medicina han dado lugar al desarrollo de diferentes herramientas para combatir a los patógenos, con las vacunas siendo las más efectivas. Una gran diversidad de vacunas existe hoy en día, con cada una teniendo sus propias características positivas y negativas. Entre ellas, las partículas similares a virus (o VLP en inglés) poseen un gran potencial, dada su gran inmunogenicidad y seguridad. Aun así, métodos para desarrollar y producir rápidamente vacunas basadas en la tecnología de VLP son necesarios para poder ser implementadas en el caso que surja una nueva epidemia o pandemia (p. ej. SARS-CoV-2).

Los métodos actuales de producción de vacunas se basan mayoritariamente en el uso de células, las cuales poseen demasiadas limitaciones a la hora de ser utilizadas durante una pandemia, incluyendo bajas posibilidades de paralelización, escalabilidad, rapidez y flexibilidad. Por esta razón, en esta tesis hemos investigado la utilización de un novedoso sistema de síntesis de proteínas sin células (CFPS) a base de tabaco (BYL, comercializado como ALiCE®) como una herramienta de preparación a las pandemias. En el segundo capítulo de esta tesis, hemos utilizado BYL para estudiar y producir rápidamente diferentes variantes quiméricas del VLP basado en el núcleo del virus de la hepatitis B (HBc). La característica reacción abierta del CFPS permitió la rápida expresión y análisis del ensamblaje de 6 diferentes HBc VLPs. De esta manera elucidamos que el dominio de proteína C-terminal del HBc VLP incrementa la estabilidad de la partícula, a cambio de una menor aceptabilidad de inserción en la región inmunomoduladora mayor. La escalabilidad de la producción de HBc VLPs en BYL también fue analizada, demostrando una relación lineal hasta 1L sin pérdidas en el rendimiento de producción. Los VLPs producidos en BYL fueron reconocidos e internalizados por células dendríticas inmaduras, y también produjeron una respuesta proinflamatoria cuando fueron expuestos a células mononucleares de sangre periférica, así probando la inmunogenicidad de esta vacuna. Estos resultados indican la aplicabilidad de BYL para producir vacunas basadas en el HBc VLP.

En la producción industrial de vacunas, el establecimiento de procesos de purificación eficientes y escalables es un proceso obligatorio para poder generar vacunas de manera económica. En el tercer capítulo, hemos estudiado la aplicación de diferentes procesos de purificación para HBc VLPs producidos en BYL. Cromatografía de interacción hidrofóbica, y no de intercambio de iones, pudo purificar eficientemente HBc VLPs, lo cual refleja la naturaleza hidrofóbica de estas partículas. Cromatografía multimodal pudo ser utilizada para reemplazar el tratamiento térmico para la clarificación previa a la cromatografía. Finalmente, la aplicación de cromatografía de afinidad bajo condiciones desnaturalizantes permitió la purificación de HBc VLPs que incorporaban aminoácidos no canónicos, los cuales modificaron las propiedades de purificación. Estos resultados demuestran el efecto drástico que pequeñas inserciones pueden tener en estructuras multiméricas, especialmente en su interacción con los grupos presentes en las resinas de purificación. El desarrollo de estos procesos de purificación también elucidó características clave que han de tenerse en cuenta en la purificación de proteínas producidas en BYL, como la presencia de ácidos nucleicos y compuestos fenólicos.

La introducción de aminoácidos no canónicos (ncaas) puede ser utilizada para aumentar la flexibilidad de vacunas basadas en VLPs. Ncaas son aminoácidos que poseen grupos reactivos que proveen nuevas funcionalidades a las proteínas en las cuales son introducidos. Incorporando grupos reactivos ortogonales a un VLP y su pareja de conjugación (p.ej. un antígeno), una conjugación post-ensamblaje puede ser realizada. La conjugación post-ensamblaje de VLPs permite su modificación con antígenos complejos, los cuales no podrían haber sido incorporados mediante fusión. En el cuarto capítulo, investigamos la incorporación de ncaa en BYL para introducir dichos grupos de conjugación ortogonal en el HBc VLP y el dominio de unión al receptor (RBD) de la hemaglutinina de la gripe. Varios sistemas de supresión ámbar fueron probados, de los cuales el sistema de transferencia de tirosina de Escherichia coli demostró los mayores rendimientos de introducción de ncaa, mientras que los sistemas de transferencia de pirrolisina de Methanosarcina mazei y Methanosarcina barkeri dieron muy bajos rendimientos, incluso cuando la transferasa fue producida y suplementada a las reacciones de BYL. La reacción de conjugación click entre proteinas RBD y HBc VLPs producidos en BYL que contenían ncaa resultó en estructuras estables, manteniendo la actividad de cada miembro de la conjugación.

En el desarrollo de vacunas, la posibilidad de investigar y producir diferentes candidatos en paralelo es muy importante. Notablemente, el cribado de alto rendimiento (CAR) de diferentes candidatos de vacunas durante una pandemia puede incrementar la velocidad de desarrollo radicalmente, especialmente cuando no existe información previa sobre la viabilidad, estructura, inmunogenicidad o producibilidad de los antígenos del patógeno usados para la vacunación. En el quinto capítulo, la aplicabilidad de BYL en CAR fue estudiada. Para ello, la utilización de diferentes formatos de plantillas genéticas fue estudiada para permitir la utilización de procesos de construcción genética in vitro más veloces. Nuestra investigación demostró la necesidad de utilización de protección contra exonucleasas en BYL. La utilización de plantillas de ADN lineares resultó en menores rendimientos que los plásmidos, posiblemente debido a un menor rendimiento de transcripción y/o menor estabilidad del ARN generado. Adicionalmente desarrollamos un nuevo proceso de circularización utilizando una reacción cíclica y una ligasa termoestable, permitiendo la rápida generación de plantillas para expresión en BYL sin una reducción en la productividad. Finalmente, también estudiamos la actividad de la transcriptasa T7 en BYL, revelando que la actividad de la pirofosfatasa no es esencial en el rendimiento de BYL. Estos resultados ayudarán en la optimización de la expresión cuando se utilicen plantillas de ADN alternativas en BYL, y, por ende, en su aplicación para aplicaciones CAR.

En conclusión, esta tesis demuestra el potencial del sistema BYL de CFPS para la investigación y producción de vacunas basadas en VLPs. La utilización del HBc VLP, en conjunto con la incorporación de ncaa y CAR establece las bases requeridas para la aplicación de BYL como una plataforma de preparación para pandemias y rápido desarrollo de vacunas.