Anoeska Van De Moosdijk

Het menselijk lichaam is opgebouwd uit naar schatting 30 biljoen cellen. Deze zijn Het menselijk lichaam is opgebouwd uit naar schatting 30 biljoen cellen. Deze zijn Het menselijk lichaam is opgebouwd uit naar schatting 30 biljoen cellen. Deze zijn
allen begonnen als één enkele cel, met de potentie om uit te groeien tot een compleet allen begonnen als één enkele cel, met de potentie om uit te groeien tot een compleet allen begonnen als één enkele cel, met de potentie om uit te groeien tot een compleet
organisme. Wij willen beter in beeld krijgen hoe de processen die dit sturen werken. organisme. Wij willen beter in beeld krijgen hoe de processen die dit sturen werken. organisme. Wij willen beter in beeld krijgen hoe de processen die dit sturen werken. organisme. Wij willen
De enkele cel waarmee het begint, is een bevruchte eicel. Deze bevat de potentie De enkele cel waarmee het begint, is een bevruchte eicel. Deze bevat de potentie De enkele cel waarmee het begint, is een bevruchte eicel. Deze bevat de potentie De enkele cel waarmee het begint, is een
om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat te om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat te om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat te om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat
doen? Hier komt DNA om de hoek kijken. DNA is aanwezig in alle cellen en als doen? Hier komt DNA om de hoek kijken. DNA is aanwezig in alle cellen en als doen? Hier komt DNA om de hoek kijken. DNA is aanwezig in alle cellen en als
molecuul waarop de genetische code is opgeslagen. Het dient als een bouwtekening molecuul waarop de genetische code is opgeslagen. Het dient als een bouwtekening molecuul waarop de genetische code is opgeslagen. Het dient als een bouwtekening molecuul waarop
voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen. voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen. voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen. voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen.
Maar alleen een bouwtekening hebben is niet genoeg: als cellen zich samen Maar alleen een bouwtekening hebben is niet genoeg: als cellen zich samen Maar alleen een bouwtekening hebben is niet genoeg: als cellen zich samen
organiseren tot een compleet lichaam, is samenwerking essentieel. Dus moeten ze organiseren tot een compleet lichaam, is samenwerking essentieel. Dus moeten ze organiseren tot een compleet lichaam, is samenwerking essentieel. Dus moeten ze
communiceren. Om dit te doen, zijn er binnen cellen meerdere netwerken van communiceren. Om dit te doen, zijn er binnen cellen meerdere netwerken van communiceren. Om dit te doen, zijn er binnen cellen meerdere netwerken van
eiwitten aanwezig, die kunnen voelen wat er aan de buitenkant gebeurt en allerlei eiwitten aanwezig, die kunnen voelen wat er aan de buitenkant gebeurt en allerlei eiwitten aanwezig, die kunnen voelen wat er aan de buitenkant gebeurt en allerlei
signalen van buiten naar de binnenkant van de cel brengen. Dit gaat via een keten signalen van buiten naar de binnenkant van de cel brengen. Dit gaat via een keten signalen van buiten naar de binnenkant van de cel brengen. Dit gaat via een keten
van eiwit, naar eiwit, naar een volgend eiwit enzovoorts. Je kunt je dit voorstellen als van eiwit, naar eiwit, naar een volgend eiwit enzovoorts. Je kunt je dit voorstellen als van eiwit, naar eiwit, naar een volgend eiwit enzovoorts. Je kunt je dit voorstellen als
een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal) naar een een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal) naar een een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal) naar een een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal)
brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn, en het brandende brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn, en het brandende brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn, en het brandende brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn
huis de kern van de cel, waar het DNA zich bevindt. Zo bereikt een signaal van huis de kern van de cel, waar het DNA zich bevindt. Zo bereikt een signaal van huis de kern van de cel, waar het DNA zich bevindt. Zo bereikt een signaal van huis d
buitenaf het DNA via het (in dit geval vrij simpele en directe) netwerk van eiwitten. buitenaf het DNA via het (in dit geval vrij simpele en directe) netwerk van eiwitten. buitenaf het DNA via het (in dit geval vrij simpele en directe) netwerk van eiwitten. buitenaf het DNA via het
De reactie die de cel dan doet, is vaak het activeren of deactiveren van specifieke De reactie die de cel dan doet, is vaak het activeren of deactiveren van specifieke De reactie die de cel dan doet, is vaak het activeren of deactiveren van specifieke
genen op het DNA. Deze genen bevatten een soort recept voor het maken van genen op het DNA. Deze genen bevatten een soort recept voor het maken van genen op het DNA. Deze genen bevatten een soort recept voor het maken van
eiwitten. Wanneer een gen wordt geactiveerd, kunnen dus nieuwe eiwitten worden eiwitten. Wanneer een gen wordt geactiveerd, kunnen dus nieuwe eiwitten worden eiwitten. Wanneer een gen wordt geactiveerd, kunnen dus nieuwe eiwitten worden
gemaakt. We noemen de eiwitnetwerken die de signalen doorgeven gemaakt. We noemen de eiwitnetwerken die de signalen doorgeven gemaakt. We noemen de eiwitnetwerken die de signalen doorgeven
"signaleringsroutes". "signaleringsroutes". "signaleringsroutes". "signaleringsroutes".
Een signaleringsroute die essentieel is voor communicatie tijdens de Een signaleringsroute die essentieel is voor communicatie tijdens de Een signaleringsroute die essentieel is voor communicatie tijdens de Een signaleringsroute die essen
ontwikkeling en later om het lichaam in evenwicht en gezond te houden (een ontwikkeling en later om het lichaam in evenwicht en gezond te houden (een ontwikkeling en later om het lichaam in evenwicht en gezond te houden (een
toestand die "homeostase" wordt genoemd), wordt de WNT-signalering of ook wel toestand die "homeostase" wordt genoemd), wordt de WNT-signalering of ook wel toestand die "homeostase" wordt genoemd), wordt de WNT-signalering of ook wel toestand die "homeostase" wordt genoemd), wordt de WNT-
WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als “wint”). De WNT pathway wordt overal WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als “wint”). De WNT pathway wordt overal WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als “wint”). De WNT pathway wordt overal WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als “wint”). De WNT pathway w
in het dierenrijk gevonden en ook bestudeerd: van vlieg tot kikker, en van vis tot in het dierenrijk gevonden en ook bestudeerd: van vlieg tot kikker, en van vis tot in het dierenrijk gevonden en ook bestudeerd: van vlieg tot kikker, en van vis tot
muis en mens. WNT-signalering zorgt voor evenwicht in twee belangrijke processen: muis en mens. WNT-signalering zorgt voor evenwicht in twee belangrijke processen: muis en mens. WNT-signalering zorgt voor evenwicht in twee belangrijke processen: muis en mens. WNT-
celdeling ("proliferatie") en cel specialisatie ("differentiatie"). Door deze in balans te celdeling ("proliferatie") en cel specialisatie ("differentiatie"). Door deze in balans te celdeling ("proliferatie") en cel specialisatie ("differentiatie"). Door deze in balans te celdeling ("proliferatie") en cel specialisatie ("differentiatie"). Door deze i & &
houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel - en die houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel - en die houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel - en die houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel -
cellen zullen van het juiste type zijn en hun juiste functie vervullen, waardoor het cellen zullen van het juiste type zijn en hun juiste functie vervullen, waardoor het cellen zullen van het juiste type zijn en hun juiste functie vervullen, waardoor het
lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit tot ziekte lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit tot ziekte lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit tot ziekte lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit
leiden. Een heel duidelijk voorbeeld hierbij is kanker, waarbij de celdeling volledig leiden. Een heel duidelijk voorbeeld hierbij is kanker, waarbij de celdeling volledig leiden. Een heel duidelijk voorbeeld hierbij is kanker, waarbij de celdeling volledig
uit de hand loopt. uit de hand loopt. uit de hand loopt. uit de hand loopt.

Addendum

WNT signalering is erg complex: zowel de muis als wij hebben maar liefst 19
verschillende genen die coderen voor WNT-eiwitten. Verschillende celtypen in het
lichaam brengen verschillende sets WNT-genen tot expressie. Daarnaast zijn er nog
tientallen andere eiwitten bij de signalering betrokken tijdens het ontvangen of
verzenden van signalen in de cel als gevolg van WNT-eiwitten. Je kunt je dit
voorstellen als niet één rij mensen die een emmertje water doorgeeft naar een brand,
maar de rij die verderop opsplitst of juist samenkomt, terwijl ook de politiechef een
bericht door laat geven voor de brandweer bij het huis, de ambulance aan de andere
kant arriveert, de pers in de weg loopt en de buren belangrijke informatie hebben.
Vanwege deze complexiteit hebben we na bijna 40 jaar onderzoek aan WNT-
signalering nog steeds grote vraagtekens over de exacte interacties die plaatsvinden
in verschillende cellen wanneer ze WNT-eiwitten tegenkomen.
In dit proefschrift hebben we nieuwe experimentele tools ontwikkeld om beter
te kunnen visualiseren en volgen hoe WNT-signalering de ontwikkeling en
homeostase van cellen en weefsels controleert, en welke eiwit interacties en
daaropvolgende genreacties plaatsvinden in cellen die WNT-signalen ontvangen.

Ieder weefsel bestaat uit een complexe 3D-omgeving, opgebouwd uit verschillende
celtypen die allemaal hun eigen gespecialiseerde functie hebben. Zo ook
borstweefsel: het bevat vetcellen, cellen die de melkkanalen vormen, de melkklieren
en ook allerlei soorten ondersteunende celtypen. We weten dat WNT-signalering
belangrijk is voor de ontwikkeling en homeostase van borstweefsel, maar we weten
ook dat veranderingen in WNT-genexpressie (hoe hard een gen aan staat, of juist uit)
moeilijk te vinden zijn bij al deze verschillende celtypen, omdat de veranderingen
vaak subtiel van aard zijn. Gevoelige technieken zijn daarom onmisbaar om deze
subtiele veranderingen te vinden. Omdat dit bij mensen lastig te bestuderen is,
gebruiken we de muis als modelorganisme.
In hoofdstuk 2 gebruiken we een techniek genaamd qRT-PCR voor het
bestuderen van subtiele veranderingen in genexpressie tijdens verschillende
ontwikkelingsstadia van de borst (ook wel mammary gland genoemd). Om de
veranderingen in genexpressie goed te kunnen kwantificeren, vereist dit
normalisatie van de data over zogenaamde referentiegenen. Het bleek echter dat de
traditioneel gebruikte referentiegenen niet zo stabiel waren als nodig over
verschillende stadia van ontwikkeling. Daarom zijn we op zoek gegaan naar nieuwe.
Door te zoeken naar stabiele genen in gepubliceerde genexpressie-datasets, hebben
we nieuwe referentiegenen weten te vinden. Vervolgens hebben we deze getest en
gevalideerd voor qRT-PCR-experimenten van de mammary gland. Met behulp van
de nieuwe referentiegenen Prdx1, Phf7 en Ctbp1 zijn we in staat om subtiele
veranderingen in de expressie van WNT-genen te detecteren tussen verschillende
ontwikkelingsstadia van de borstklier.

Borstweefsel groeit tijdens de puberteit uit, maar ook in een volwassen situatie zijn
de cellen in het weefsel ontzettend actief. Elke voortplantingscyclus bereiden de
melkkanalen zich voor op een mogelijke zwangerschap door zich uit te breiden. Komt
die niet, verdwijnen de kanalen weer. Bij de muis duur zo’n cyclus slechts 4-5 dagen.
Je kunt je dus voorstellen dat de celgroei voor deze ontwikkelingen goed
gecontroleerd moet worden. Hiervoor zijn speciale cellen, genaamd borststamcellen,
die heel veel celtypes in de borst kunnen maken. Wij willen weten waar die
stamcellen zich bevinden en hoe ze precies bijdragen aan de opbouw van het
borstklierweefsel, zowel tijdens de ontwikkeling en gedurende de cycli. In
hoofdstuk 3 beschrijven we een methode om dit te volgen in intacte borstklieren
van muizen genaamd lineage tracing. Lineage tracing stelt ons in staat cellen te
labelen, waardoor we ze kunnen vinden in het weefsel, en ook hun dochtercellen
kunnen volgen na celdeling. In het hoofdstuk bespreken we de voor- en nadelen van
twee verschillende genetische technieken om borststamcellen te kunnen volgen.
Bij lineage tracing wordt gebruik gemaakt van genetisch gemodificeerde
muismodellen, waarbij een muis zowel een zogenaamd "driver-gen" als een
“reportergen” in het genoom heeft. Die driver zorgt er met een soort genetische
schakelaar voor dat de reporter aan of uit gaat. Wij kunnen de schakelaar aanzetten
door de muis een stofje toe te dienen. De reporter bestaat uit een fluorescent eiwit,
dat zichtbaar gemaakt kan worden onder een fluorescentie microscoop. Op het
moment dat de schakelaar dus aan wordt gezet, lichten de stamcellen op. Omdat dit
een permanente “aan” schakelaar betreft (er is geen “uit”), zal de cel de fluorescentie
doorgeven aan dochtercellen wanneer zij deelt. Op deze manier is zowel de stamcel
als het nageslacht van de stamcel te volgen in een weefsel.

Er zijn al verschillende driver en reporter muislijnen beschikbaar voor lineage
tracing. We merkten echter dat de huidige drivers niet echt geschikt waren om
stamcellen in de borstklier te bestuderen. Daarom beschrijven we in hoofdstuk 4
een nieuw genetisch muismodel (met de naam Axin2 P2A-rtTA3-T2A-3xNLS-SGFP2 ) waar een
dubbele functie in is gebouwd: het dient als driver voor lineage tracing, maar laat
ook de stamcellen die WNT-signalen ontvangen direct oplichten via een groen
fluorescerend eiwit. Deze dubbele functie stelt ons in staat om cellen die WNT
signalen ontvangen direct op te laten lichten, en tegelijkertijd hun afkomst te volgen
lineage tracing. Deze dubbele functie was nog niet beschikbaar voor stamcellen die
Axin2 tot expressie brengen, een belangrijk gen dat reageert op WNT signalen in de & &
meeste weefsels. We laten zien dat dit nieuwe Axin2 muismodel op een juiste manier
WNT signalering rapporteert, en dat we het ook kunnen gebruiken als een driver
voor lineage tracing.

Vervolgens hebben we ook een vernieuwde driver lijn gemaakt, zoals beschreven in
hoofdstuk 5. Hier ontwikkelen en analyseren we een nieuwe genetische reporter

Addendum

(genaamd Rosa26 PRIME ). We combineren gewenste eigenschappen van verschillende
reeds bestaande modellen met de nieuwst fluorescente eiwitten. Deze reporter bevat
de optie zodat één van drie verschillende fluorescerende eiwitten (rood, cyaan en
geel) tot expressie komt na het aanzetten van de schakelaar. Hierdoor kunnen we
stamcellen die vlak bij elkaar zitten beter uit elkaar houden, omdat ze verschillende
kleuren kunnen krijgen. De reporter staat voor het aanzetten van de schakelaar in
alle cellen van de muis reeds aan met een ver-rood fluorescerend eiwit. Dit zorgt
ervoor dat het weefsel makkelijk te bekijken is onder de microscoop.

Het maken van genetisch gemanipuleerde muismodellen is een lang en uitdagend
proces. De recent ontwikkelde CRISPR/Cas9 genoom editing techniek belooft dat dit
sneller kan. Om dat te testen hebben we in hoofdstuk 6 daarom getest wat we
kunnen met CRISPR/Cas9. Daarbij beginnend in menselijke en muis cellijnen. We
zijn begonnen om het genoom te veranderen voor een gen dat centraal staat in WNT
signalering: het gen voor beta-catenine (genaamd Ctnnb1). Met hulp van
CRISPR/Cas9 kunnen we Ctnnb1 in cellen aanpassen, zoals een kleine mutatie
aanbrengen waardoor het resulterende eiwit altijd actief is, of zelfs een heel gen voor
een fluorescerend eiwit inbouwen waardoor een fusie ontstaat van dat fluorescente
eiwit en beta-catenine. Vervolgens zijn we deze techniek ook gaan optimaliseren in
muizen embryo’s, zodat we een genetisch gemodificeerde muis kunnen maken. Na
verschillende pogingen hebben we een methode gevonden die efficiënt is, waardoor
gemiddeld 1 op de 8 muizen de door ons ontworpen genetische modificatie draagt.
Op deze manier hebben we muizen gemaakt die een fusie-eiwit dragen van een
fluorescerende beta-catenine. Hierdoor kunnen we onder de microscoop precies
volgen hoeveel er van is in verschillende cellen, en zo leren wat het daar doet.

Dit proefschrift beschrijft de ontwikkeling van verschillende nieuwe gereedschappen
(“tools”) om WNT signalering in het modelorganisme de muis te meten, visualiseren,
en volgen op het daadwerkelijke niveau dat het normaal ook in de cel voorkomt.
Samen vormen deze tools een sterke basis voor toekomstige generaties
wetenschappers om de mechanismen van WNT signalering te bestuderen, en te
ontrafelen wat de precieze rol is van WNT signalering in ontwikkeling, homeostase
en ziekte.