Till Mathan

Monocyten zijn meegenomen op basis van hun overlappende eigenschappen en functies. De gegenereerde data is gecombineerd met bestaande mRNA data om een robuuster celspecifiek overzicht te creëren. Met behulp van deze dataset zijn subset-specifieke receptoren geïdentificeerd en is aangetoond dat pDCs geen Caspase-1 bezitten en hierdoor ook geen IL-1β kunnen afscheiden.

Als voortzetting van de resultaten met betrekking tot de verschillen in IL-1β uitstoot tussen de DC subsets, hebben wij in Hoofdstuk 4 naar de gevoeligheid voor IL-1β gekeken. Hier zijn pDCs en CD1c+ mDCs met IL-1β geïncubeerd. Hier kwam uit dat pDCs IL-1β niet als activatiestimulus waarnemen en dus geen verandering in de expressie van de maturatie markers plaatsvindt. Bovendien is aangetoond dat de expressie van de receptor voor IL-1β, en een aantal moleculen downstream van de receptor minder tot expressie komen in pDCs. Daarmee laten we zien dat pDCs niet alleen geen IL-1β produceren, maar hier ook niet op reageren.

In Hoofdstuk 5 is gekeken naar de effectiviteit van klinische adjuvanten op CD1c+ mDCs en pDCs met behulp van RNA-sequencing (RNA-seq). Hierbij wordt het effect van oude, in de kliniek gebruikte stimuli vergeleken met huidige of toekomstige klinische stimuli. Deze resultaten en datasets geven een uitstekend inzicht in hoe de subsets zich gedragen als zij in een klinisch relevante toestand gebracht worden. Door middel van deze resultaten is meer kennis over deze subsets verzameld, wat zal bijdragen aan het verder verbeteren van de DC immuuntherapie.

Hoofdstuk 6 gaat over de communicatie (crosstalk) van in Hoofdstuk 5 beschreven DC subsets: CD1c+ mDCs en pDCs. Bij deze studie hebben wij onderzocht hoe deze twee subsets elkaar beïnvloeden op basis van twee belangrijke cytokinen. Wij hebben ons gericht op de type I cytokinen, welke door pDCs geproduceerd worden, en op IL12p70, dat in hoge mate vrijkomt bij gestimuleerde CD1c+ mDCs. Op basis van onze resultaten is aangetoond dat een verhoogd type I productie een activerend effect op CD1c+ mDCs en andere immuuncellen heeft.

In Hoofdstuk 7 wordt de in kleine percentages voorkomende DC subset BDCAP+ mDCs bestudeerd. Net als in Hoofdstuk 5 wordt gebruik gemaakt van RNA-seq en aanvullend een microarray methode. Wij vergelijken de potentie van twee verschillende klinische adjuvants. Deze resultaten dragen bij aan een keuze tussen deze twee adjuvants voor een toekomstige BDCAP+ mDC immuuntherapie. Op basis van onze resultaten lijken beide adjuvants even sterk en laten ze geen grote verschillen op basis van hun effect op dit celtype zien.

Tot slot wordt het proefschrift in Hoofdstuk 8 samengevat en worden conclusies met betrekking tot toekomstige ontwikkelingen getrokken. De opgedane resultaten worden in context geplaatst en de meerwaarde voor wetenschappelijk onderzoek wordt benadrukt.

CHAPTER 10 Deutsche Zusammenfassung

Die vorliegende Doktorarbeit gibt einen Überblick über die Erforschung von dendritischen Zellen, bezogen auf die Krebs-Immuntherapie. Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen (APC) und sind mit dem adaptiven Immunsystem verbunden. Sie sind in der Lage, Pathogene zu absorbieren und sie auf ihrer Oberfläche anderen Zellen zu präsentieren. Die aktivierten DCs wandern daraufhin zu den Lymphknoten und aktivieren ihrerseits die sogenannten Effektor-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen. Innerhalb der DCs gibt es verschiedene Untergruppen, die jeweils mit spezifischen Eigenschaften und Funktionen ausgestattet sind. Einige sind in der Lage, virale pathogene (plasmazytoide DCs) zu erfassen, Andere wiederum sind spezialisiert, bakterielle Pathogene (myeloide DC) aufzuspüren. Unsere Abteilung, Tumorimmunologie, hat außergewöhnlich große Erfahrungen mit dendritischen Zellen und ihre Verwendung für Krebsimmuntherapien. Bei dieser Art von Therapie nutzen wir die antigen-aufnehmende Eigenschaften der DCs und unterstützen ihre Fähigkeit, Tumorzellen zu finden. Dafür werden die DCs von Krebspatienten isoliert und außerhalb des Körpers (ex vivo) aktiviert. Daraufhin werden sie mit tumorspezifischen Antigenen „gefüttert“, in dem Glauben, Tumorzellen aufgespürt zu haben. Anschließend werden die Zellen dem Patienten wieder zurückgeführt, indem sie in den Lymphknoten injiziert werden. Hier aktivieren die dendritischen Zellen die T-Zellen durch ihren aktivierten Zustand und die präsentieren die tumorspezifischen Antigene auf ihrer Oberfläche. Auf welche Weise die T-Zellen aktiviert werden, hängt von mehreren Faktoren ab.

Hier spielen die kostimulatorischen Moleküle auf der Oberfläche der dendritischen Zellen eine wichtige Rolle. Diese direkte Zell-Zell-Wechselwirkung gibt den Ausschlag, ob eine T-Zelle aktiviert oder gehemmt wird. Bekannte kostimulatorische Moleküle sind CD80, CD86 oder CD40. Im Gegensatz dazu ist PD-L1 ein sehr intensiv untersuchtes und sehr wichtiges koinhibitorischen Molekül. Aus diesem Grunde stellt das Inhibieren oder Ausschalten der PD-L1-Expression auch ein bekanntes Ziel innerhalb der Krebsforschung dar. Desweiteren spielen Zytokine eine wichtige Rolle bei der T-Zell-Stimulation. Zytokine sind Signalmoleküle, die von Zellen abgegeben werden und in der Lage sind, andere Zellen zu regulieren oder auch Informationen weiterzugeben.

Kapitel 1 ist eine Einleitung in das Thema der Promotionsarbeit. Hier erkläre ich in einer kurzen Zusammenfassung, was dendritische Zellen sind, welche Bedeutung die effektive Stimulation einnimmt und gebe einen Überblick über DC-Immuntherapie.

Kapitel 2 ist eine wissenschaftliche Literaturstudie über plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs). In diesem Kapitel wird die Wechselwirkung der pDCs mit anderen Immunzellen beschrieben und ihre bedeutende und weitreichende Rolle herausgehoben.

In Kapitel 3 werden unstimulierte DC-Subsets und ein DC-ähnliches Monozyten-Subset, welches dendritischen Zellen sehr ähnlich ist, auf der Grundlage ihrer Proteinexpression miteinander verglichen. Durch den Gebrauch von Massenspektrometrie war es möglich eine unvoreingenommene Übersicht der Proteine in diesen Zellen darzulegen. Zusätzlich zu den pDCs, wurden auch myeloide dendritische Zellen (mDCs), die BDCAP+ mDC und CD1c+ mDC Subsets untersucht. Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit DCs befinden sich ausserdem CD14+-Monozyten unter den untersuchten Subsets. Die gewonnenen Daten wurden mit vorhandenen mRNA-Daten kombiniert, um ein robustes zellspezifisches Expressionsmuster zu erstellen. Mithilfe von zahlreichen Analysen des Datensatzes haben wir subset-spezifische Rezeptoren identifiziert und waren in der Lage zu beweisen, dass in pDCs das Protein Caspase-1 nicht vorhanden ist und daher pDCs kein IL-1β ausschütten können.

Hinzufügend zu den Unterschieden von IL-1β-Ausschüttung zwischen den DC-Subsets im vorigen Kapitel, wird in Kapitel 4 die Sensitiviät der DC-subsets auf IL-1β untersucht. Dabei wurden pDCs und CD1c+ mDCs mit IL-1β inkubiert und die Effekte gemessen. Hierbei hat sich gezeigt, dass pDCs IL-1ß nicht als aktivierenden Reiz wahrnehmen und daher keine Reifungsmarker auf der Zelloberfläche repräsentieren. Außerdem konnten wir mithilfe dieser Studie beweisen, dass die Expression des IL-1β-receptors, ILNRN, und mehreren nachgeschalteten Proteinen des ILNRN-Signalwegs in pDCs schwächer ausgebildet sind. Somit demonstrieren wir, dass pDCs sowohl kein IL-1β produzieren können, als auch IL-1β nicht als Reifungstimulus wahrnehmen.

In Kapitel 5 bewerten wir die Wirksamkeit der klinischen Adjuvanten in CD1c+ mDCs und pDCs unter Verwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-Seq). Hier vergleichen wir die Wirkung bisheriger Stimuli mit den jetzigen, beziehungsweise zukünftigen, klinischen Adjuvanten. Die erfassten Ergebnisse und Datensätze bieten einen Einblick, wie unterschiedlich sich die Subsets verhalten, wenn sie in einen aktivierten und klinischen Zustand versetzt werden. Diese Ergebnisse helfen uns, unser Wissen über DCs zu erweitern und werden dazu beitragen, die DC-Immuntherapie kurzfristig und langfristig zu verbessern.

In Kapitel 6 werden die Wechselwirkungen (cross-talk) zwischen den in Kapitel 5 beschriebenen DC-Subsets pDCs und CD1c+ mDCs studiert. In dieser Studie wird untersucht, welche Rolle Zytokine bei dieser Wechselwirkung spielen. Einfachheitshalber haben wir uns auf Typ-I-IFNs, welche von pDCs produziert werden, und IL12p70, welches in großen Mengen von CD1c+ mDCs ausgeschüttet wird, konzentriert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine erhöhte Typ-I-interferon (IFN)-Produktion der pDCs eine aktivierende Wirkung auf CD1c+ mDCs und andere Immunzellen hat.

In Kapitel 7 widmen wir uns einem eher seltener vorkommenden DC-Subset, den BDCAP+ mDCs. Wie bereits in Kapitel 5 untersuchen wir auch hier den Effekt von klinischen Stimuli in diesem Falle dann bei BDCAP+ mDCs. Diesmal verwenden wir neben der bereits erwähnten RNA-Seq-Methode zusätzlich ein Mikroarray-Verfahren. Wir vergleichen das Potenzial von zwei verschiedenen klinischen Stimuli, pRNA und Hiltonol (TLR-Ligand). Diese Ergebnisse helfen uns bei der Wahl zwischen diesen beiden Adjutanten für zukünftige BDCAP+ mDC Immuntherapie-Studien. Unsere Ergebnisse zeigten auf, dass beide Adjuvanten zu einem Reifungsprozess der BDCAP+ mDCs führte und wiesen sehr große Gemeinsamkeiten bezüglich ihrer Wirkung auf diesen Zelltypen auf.

Abschließend fasse ich die These in Kapitel 8 zusammen und ziehe Schlussfolgerungen in Bezug auf die zukünftige Entwicklung. Darüberhinaus setzen wir hier die erzielten Resultate in den Kontext der heutigen Forschung und heben den Mehrwert dieser Ergebnisse für die Forschungsgemeinschaft hervor.