Thijs Moerenhout

In dit proefschrift werden diervrije methoden voor de volgende generatie risicobeoordeling van organofosfaatpesticiden geëvalueerd. Deze benaderingen zijn gebaseerd op in silico en in vitro methoden en werden geëvalueerd voor het voorspellen van de veiligheid van menselijke blootstellingen, evenals startpunten (points of departure) voor de remming van acetylcholinesterase (AChE) door organofosfaatpesticiden. Dit werd bereikt door de ontwikkeling van een generiek fysiologisch gebaseerd kinetisch (PBK) model voor organofosfaatpesticiden, in vitro kwantificering van AChE-remming door verschillende organofosfaatpesticiden, blootstellingsveiligheidsevaluatie met behulp van de dietary comparator ratio (DCR) methode, en voorspelling van het startpunt voor gevarenkarakterisering met behulp van kwantitatieve in vitro naar in vivo extrapolatie (QIVIVE) van in vitro AChE-remming naar de in vivo situatie.

Hoofdstuk 1 introduceert essentiële informatie over organofosfaatpesticiden met betrekking tot hun gebruik, chemie, kinetiek en effecten. Ook wordt uitgelegd hoe traditionele risicobeoordeling wordt uitgevoerd en hoe diervrije in vitro en in silico methoden kunnen worden gebruikt om risicobeoordeling uit te voeren zonder dierproeven. Ten slotte wordt het doel van het proefschrift gepresenteerd.

In hoofdstuk 2 werd een PBK-model ontwikkeld om bloedconcentraties van acht organofosfaatpesticiden en hun metabolieten in ratten en mensen te voorspellen. Het ontwikkelde PBK-model voorspelt hoe organofosfaten worden geabsorbeerd, gedistribueerd, gemetaboliseerd en uitgescheiden in/uit het lichaam, gebaseerd op in vitro of in silico afgeleide parameters. Het PBK-model werd gevalideerd met behulp van uit de literatuur verkregen bloedconcentratie-tijdgegevens van in vivo blootstellingsstudies. Bij het valideren van het model konden bloedconcentraties van de meeste organofosfaatpesticiden worden voorspeld binnen een factor 5 verschil van in vivo waarden. De pesticiden die minder goed werden voorspeld, bleken allemaal te behoren tot de subklasse van dimethyl-organofosfaatpesticiden.

Het ontwikkelde PBK-model werd in hoofdstuk 3 gebruikt om te onderzoeken of de DCR-methode betrouwbaar kan worden gebruikt voor de veiligheidsevaluatie van organofosfaatpesticiden. Zes organofosfaatpesticiden werden gebruikt om de DCR-methode te evalueren. De DCR-methode voorspelde correct dat 70 van de 74 blootstellingen veilig waren wanneer deze inderdaad werden gerapporteerd als zijnde zonder nadelige effecten. Vier blootstellingsscenario's werden voorspeld als gevaarlijk, terwijl deze in de literatuur als veilig werden gerapporteerd. De vier fout-positieven waren allemaal voor dimethyl-organofosfaten. Er werd geconcludeerd dat de DCR-methode in de toekomst kan worden gebruikt voor de veiligheidsevaluatie van blootstellingen aan organofosfaatpesticiden, aangezien werd aangetoond dat deze nauwkeurig het optreden van nadelige effecten na blootstelling aan deze pesticiden voorspelt.

In hoofdstuk 4 werd onderzocht of de overvoorspelling van de dimethyl-organofosfaten fenitro-oxon, methyl-paraoxon en omethoaat te wijten zou kunnen zijn aan een metabole route die niet in het PBK-model was opgenomen. In vitro metabolismestudies toonden aan dat methyl-paraoxon en omethoaat werden gemetaboliseerd via een glutathione-gemedieerde route. Bovendien bleken ratten methyl-paraoxon vier keer sneller te metaboliseren dan mensen via deze route. Wanneer de glutathione-gemedieerde metabole route werd opgenomen in het PBK-model, verbeterden de bloedvoorspellingen voor methyl-paraoxon en fenitro-oxon van een meer dan 10-voudig verschil (wanneer glutathione-gemedieerd metabolisme niet was inbegrepen) naar minder dan 5- en vaak zelfs 2-voudige verschillen vergeleken met in vivo rattengegevens. Voor omethoaat werden geen significante veranderingen in voorspelde bloedconcentraties waargenomen. Voor mensen waren de voorspelde maximale concentraties voor blootstelling aan methyl-parathion en fenitrothion meer dan 12 keer lager wanneer glutathione-gemedieerd metabolisme in het model werd opgenomen.

De kwantitatieve in vitro naar in vivo extrapolatiebenadering werd gebruikt voor de bepaling van het startpunt van AChE-remming door organofosfaatpesticiden in hoofdstuk 5. Voor acht organofosfaatpesticiden en hun actieve metabolieten werden concentratie-responscurves afgeleid van in vitro AChE-remmingsassays met bloed of puur enzym. Voor elk pesticide werden zowel de volbloed- als de enzym-concentratie-responscurves vertaald naar dosis-responscurves met behulp van het aangepaste PBK-model ontwikkeld in hoofdstuk 4. Benchmark-dosismodellering werd gebruikt op de dosis-responscurves om startpunten te voorspellen, die vervolgens werden vergeleken met in vivo bepaalde startpunten gerapporteerd in de literatuur. Alle voorspelde startpunten, voor zowel ratten als mensen, lagen binnen een factor 4 van de in vivo bepaalde startpunten voor laagst-waargenomen-nadelig-effectniveaus (LOAELs) en waren hoger dan de gerapporteerde geen-waargenomen-nadelig-effectniveaus (NOAELs). Voor sommige organofosfaatpesticiden was het niet mogelijk een startpunt te bepalen op basis van volbloedgegevens, mogelijk als gevolg van niet-AChE-esterases die aanwezig zijn in volbloed. Er werd aangetoond dat op QIVIVE gebaseerde bepaling van het startpunt kan worden gebruikt voor diervrije gevarenkarakterisering van organofosfaatpesticiden wanneer puur enzym wordt gebruikt voor AChE-remmingsassays.

In hoofdstuk 6 worden de resultaten van elk experimenteel hoofdstuk samengevat. Overwegingen met betrekking tot chronische en mengselblootstellingen worden besproken en de associatie van organofosfaatpesticiden met neurodegeneratieve ziekten wordt kort aangestipt. Voor PBK-modellering worden enkele mogelijkheden in detail besproken, waarbij de focus ligt op voedseleffecten op orale absorptie, lymfetransport, het vereiste fysiologische detail dat nodig is in een PBK-model, groei- en populatiemodellering en beperkingen van en oplossingen voor in vitro en in silico afleiding van kinetische parameters. Ten slotte werden modelvalidatie en de adoptie van diervrije risicobeoordeling besproken.

De bevindingen in dit proefschrift laten zien hoe verschillende in vitro en in silico benaderingen kunnen worden gebruikt voor de volgende generatie veiligheidsbeoordeling van organofosfaatpesticiden. Het gebruik van deze benaderingen voor zowel ratten als mensen leverde ook waardevolle inzichten op in soortverschillen. Al deze bevindingen ondersteunen de gedachte dat dieren die worden gebruikt in toxiciteitstests mensen niet altijd goed vertegenwoordigen. Daarom zijn de mensgerichte gegevens geleverd door diervrije benaderingen essentieel voor de chemische risicobeoordeling voor mensen.