Rita Guimaraes

In dit proefschrift onderzoeken we de rol van repetitief DNA in de genetische architectuur van de ziekte van Alzheimer, met een focus op hoe structurele variaties in TRs en TEs kunnen bijdragen aan de vatbaarheidvoor de ziekte. Hoewel GWAS-onderzoeken talrijke risicoloci voor AD hebben geïdentificeerd, blijft een aanzienlijk deel van de erfelijkheid onverklaard. Ons doel is om verborgen genetische variaties binnen AD-geassocieerde regio’s op te sporen en hun potentiële genregulerende functies te beoordelen door genetische, epigenetische en transcriptomische analyses te integreren. Met dit werk hopen we nieuwe inzichten te bieden in de genetische basis van AD.

In hoofdstuk 1 beginnen we met een uitgebreid overzicht van AD-geassocieerde loci, waarbij we structurele varianten van repetitief DNA in elk locus in overweging nemen. Met behulp van een gepubliceerde GWAS hebben we een fine-mapping analyse uitgevoerd en 29 genomische risicoloci (GRL) geïdentificeerd die geassocieerd zijn met AD. Binnen de grenzen van de GRL hebben we een dataset van structurele varianten geïntegreerd en 202 varianten in 16 GRL gevonden. Opvallend is dat clusters van intergene, door GWAS geïdentificeerde SNP’s zich rondom structureel variabele SVA’s (SV-SVA’s) bevinden; daarom geven we prioriteit aan deze loci voor verdere functionele analyse.

Hoofdstuk 2 onderzoekt structurele variatie in TE’s die actief zijn gebleken in een neuronale omgeving, en hun associatie met neurologische aandoeningen. We gebruikten gepubliceerde long-read sequencing en PCR-analyse om de hoge mate van structurele variatie van SVA-elementen in het gehele menselijke genoom bloot te leggen. Gezien een aanzienlijk aantal SV-SVA’s zich bevindt in loci die geassocieerd zijn met neurologische aandoeningen, hebben we de functionele impact van deze elementen onderzocht in 3 loci: BIN1 en CD2AP, geassocieerd met Alzheimer, en BCKDK, geassocieerd met de ziekte van Parkinson. Genetische deleties van de SV-SVA’s werden aangebracht in humane embryonale stamcellen met behulp van het CRISPR-Cas9-systeem, waarna corticale organoïden werden gegenereerd als model voor een neuronale omgeving. Epigenetische kenmerken veranderden na deletie van de BCKDK-SV-SVA, in genen nabij de deletieplaats, en transcriptomische analyse toonde differentiële expressie van FUS, 75 kb verderop. Er werden geen epigenetische of transcriptomische veranderingen waargenomen bij de BIN1-SVA-KO. Wat betreft de intronische CD2AP-SVA werd RNA CaptureSeq uitgevoerd, waaruit verminderde expressieniveaus bleken voor alle CD2AP-exonen stroomafwaarts van de SVA-insertieplaats. Samengevat laten onze bevindingen een nieuwe laag van verborgen genetische variatie zien waarmee rekening moet worden gehouden bij het inschatten van het risico op complexe ziekten.

In hoofdstuk 3 zetten we het werk uit hoofdstuk 1 voort door een functionele beoordeling te geven van twee SV-SVA’s die zich respectievelijk in of stroomopwaarts van de AD-geassocieerde genen PSEN1 en PICALM bevinden. Hier gebruiken we dezelfde methode als beschreven in hoofdstuk 2: we genereerden SV-SVA KO corticale organoïden en voerden RNA CaptureSeq uit voor een hoge resolutie van het locus-transcriptoom. Er was geen bewijs voor een regulerend effect van de SV-SVA in het PICALM-gen in de context van een neuronale omgeving. Bij deletie van de intronische SV-SVA in PSEN1 toonden voorlopige bevindingen echter verhoogde expressieniveaus aan van transcripten die geassocieerd zijn met nonsense-mediated decay.

In hoofdstuk 4 duiken we in een genetische associatiestudie om VNTR’s te identificeren die geassocieerd zijn met AD-risico. We gebruiken een short-read sequencing dataset van het ADSP-cohort om VNTR’s te detecteren waarvan de lengte is toegenomen of afgenomen bij het merendeel van de AD-patiënten, of bij een subgroep daarvan, in vergelijking met controles. We ontdekten 52 VNTR’s met een suggestieve associatie met de ziekte, waarvan 5 werden gerepliceerd in een onafhankelijke long-read sequencing dataset bestaande uit AD-patiënten en cognitief gezonde honderdjarigen. We lichten de meest veelbelovende AD geassocieerde VNTR eruit, gelegen in een regulerend element binnen het RTEL1-gen, in het promotorgebied van TNFRSF6B en in het fusietranscript RTEL1-TNFRSF6B. RTEL1 is een verouderingsgerelateerd gen dat betrokken is bij celhomeostase, terwijl TNFRSF6B, dat een immunosuppressieve functie heeft, geassocieerd is met AD. Waar kortere lengtes van de VNTR geassocieerd zijn met AD, correleren langere lengtes met een beschermende GWAS-SNP rs55765053 in TNFRSF6B, die op zijn beurt in matige LD staat met de belangrijkste beschermende SNP rs6742. Verdere functionele analyse is nodig om onze voorlopige bevindingen te valideren.