Margriet Roelse

Dit proefschrift beschrijft de ontwikkeling van een technologie om G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR’s) te onderzoeken door middel van een gerangschikt raster (array) van receptor producerende cellen (~ 300 spots) omsloten in een microfluidisch systeem. Deze technologie is ontwikkeld met het doel om smaak en/of de actieve ingrediënten in complexe monsters te bepalen. De activatie van de GPCR’s wordt gemeten met behulp van een genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI). Deze indicator is gebaseerd op het principe van FRET (Förster Resonance Energy Transfer) tussen twee fluorescente eiwitten welke gekoppeld zijn door middel van een calcium bindend domein. Wanneer deze indicator calcium bindt, dan verandert de conformatie tussen de fluoroforen. Het cel-array van verschillende receptoren is gemaakt door middel van een omgekeerde transfectie techniek waarbij geprint plasmide DNA opgenomen wordt door de cellen. De rasters worden vervolgens geassembleerd in een vloeistofkamer (flowcell), welke aangesloten wordt op een microfluidisch systeem, en geplaatst onder een stereo fluorescentie microscoop. Met deze opzet is het mogelijk om het cel-array gecontroleerd en herhaaldelijk bloot te stellen aan monsters en de cellulaire reacties door middel van de calcium indicator te meten.

GPCR’s spelen een belangrijke rol in veel fysiologische en ziekte gerelateerde processen. Deze membraan eiwitten zijn geëvolueerd om een breed scala aan moleculen te herkennen, van zowel exogene of endogene oorsprong. Het signaal mechanisme is complex en heeft de potentie veel verschillende signaleringsstappen te omvatten, afhankelijk van het cel type. Het hoofdstuk “Introduction” van dit proefschrift geeft een kort overzicht van de verschillende GPCR types en hun mogelijke signaleringsstappen, met een focus op de smaak signalering. Dit hoofdstuk laat ook zien waar deze microfluidische techniek staat binnen het bestaande GPCR onderzoek veld.

Het tweede hoofdstuk onderzoekt de algemene principes, de opzet en de karakteristieken van het microfluidisch systeem om GPCR activatie te meten door middel van calcium veranderingen in HEK293 cellen. Deze cellen produceerden een combinatie van de Neurokinine-1 receptor en het Cameleon YCP.6 eiwit als calcium indicator. Er is een stabiele cel lijn gebruikt welke zorgt voor een robuuste productie met weinig variatie.

Naast GPCR’s is het systeem ook gebruikt om activatie te meten van calcium ion kanaal TRPV1 met behulp van Cameleon YCP.6 zoals te lezen is in hoofdstuk 3. Deze analyse, uitgevoerd met LCMS fracties en volledige extracten van chili peper vruchten, leidde tot de ontdekking van nieuwe TRPV1 agonisten. Dit hoofdstuk bespreekt tevens de mogelijkheid om de receptomics techniek direct te koppelen aan de LCMS en te gebruiken als een gekoppelde bio-activiteit meter. De algemene discussie van dit proefschrift (hoofdstuk 7) gaat hier verder in op met verdere perspectieven over de haalbaarheid van de koppeling van deze twee systemen.

Hoofdstuk 4 geeft een uitgebreide technische karakterisatie van de vervaardiging en de meting van omgekeerd getransfecteerde cel-arrays met gebruik van fluorescente eiwitten. Het signaal van de Neurokinine-1 receptor in relatie tot de gen dosis tijdens de transfectie is bestudeerd en daarbij ook de reproduceerbaarheid van reacties gedurende herhaaldelijke blootstellingen.

Deze resultaten leidden tot een studie naar de gevoeligheid van de bittere smaak receptoren en gevoeligheidsbepalende factoren zoals sensor type en calcium buffering (hoofdstuk 5). Het doel van dit hoofdstuk was om de gevoeligheid en robuustheid van de receptor meet techniek te verhogen en leverde een proof-of-concept dat arrays met bittere smaak receptoren kunnen presteren met vergelijkbare gevoeligheid als bestaande technieken. Deze bittere smaak receptor arrays kunnen gebruikt worden voor toekomstige onderzoeken naar nieuwe bittere smaak moleculen of modulatoren van bittere smaak en de identificatie van bitterheid voeding.

De ontwikkeling van software en statistische modellen –het lineair mixed model, zoals gepresenteerd in hoofdstuk 6- om deze nieuwe data te analyseren, toonde aan dat een analyse gebaseerd op herhaaldelijke blootstellingen van een enkele spot de meest betrouwbare gegevens opleverde en de verschillen in signaalsterkte tussen de stipjes grotendeels uitschakelde. Deze methode kon ook receptor specifieke verschillen tussen monsters aantonen in de aanwezigheid van een gesimuleerd moedercelsignaal. Een moedercelsignaal, geïnduceerd door ATP, is gebruikt om aan te tonen dat een specifieke bitter receptor signaal door toevoeging van een bittere stof een cumulatief signaal opleverde boven op het moedercelsignaal en dat deze onttrokken kon worden van het moedersignaal door middel van vergelijkend onderzoek.

De algemene discussie (hoofdstuk 7) bevat een kritische bespreking van de voordelen en beperkingen van deze nieuwe microfluidische benadering en gaat verder in op aanvullende ontwikkelingen die nodig zijn om de technologie vooruit te helpen. De receptomics technologie zoals beschreven in dit proefschrift wordt als complementair beschreven aan de bestaande receptor onderzoeks methoden en vertegenwoordigt een nieuw analytisch paradigma. Het microfluidisch aspect en algemene afname van de afmetingen van een proefopzet zijn kosten efficiënter en maken het mogelijk om zowel een hoog inhoudelijke analyse uit te voeren en nieuwe toepassingen te ontwikkelen zoals de directe identificatie van bioactieve stoffen door de koppeling van LCMS aan de receptomics.

Welbeschouwd presenteert dit proefschrift een techniek voor receptor onderzoek gebaseerd op nieuwe ontwerp principes. Deze receptomics techniek biedt nieuwe toepassingen en heeft potentieel om bio-activiteit te meten in ruwe extracten.