Raimond Heukers

Kanker wordt gekenmerkt door ongecontroleerde groei en deling van cellen. Kankercellen zijn in staat zichzelf te voorzien van groeisignalen en/of kunnen zich onbeperkt repliceren. Naast chirurgie, bestraling en chemotherapie kan een anti-kanker behandeling ook bestaan uit therapieën die zich richten tegen specifieke tumor-gerelateerde moleculen. Voorbeelden hiervan zijn small molecule inhibitors, siRNAs en immunotherapie. De laatstgenoemde aanpak maakt gebruik van antilichamen die het immuunsysteem activeren of specifieke tumor-gerelateerde signaleringspaden blokkeren. Helaas wordt de tumorgroei vaak alleen geremd door de antilichamen en wordt de tumor niet volledig verwijderd. De specifieke anti-kanker activiteit kan verbeterd worden door de tumor-specificiteit van antilichamen te combineren met de toxiciteit van een therapeutisch middel. Deze antilichaam-geneesmiddel conjugaties (antibody-drug conjugates, ADC) verhogen de effectiviteit van antilichamen waardoor de kans op bijwerkingen van de chemotherapie wordt verminderd.

Voor een optimale ophoping en verdeling van zulke ADCs in de tumor zijn de specificiteit, bindingsaffiniteit, en de grootte van het antilichaam belangrijk. Conventionele antilichamen zijn relatief groot, wat leidt tot een relatief slechte tumorpenetratie en distributie. Daarom zijn er in de laatste decennia verschillende soorten kleinere antilichaamfragmenten ontwikkeld. Een voorbeeld hiervan is het variabele domein van de zware-keten-antilichamen van lama’s (VHH of nanobody). Een overzicht van het gebruik van nanobodies bij anti-kanker therapie wordt gegeven in Hoofdstuk 2. Nanobodies die gebruikt worden voor het bezorgen van therapeutische moleculen worden ‘Nanobullets‘ genoemd. Omdat vele therapeutische, en in dit geval toxische moleculen intracellulair functioneren, binden ideale Nanobullets niet alleen aan tumorcellen, maar regelen ze ook de intracellulaire afgifte van het therapeutisch molecuul. Voor het ontwikkelen van een Nanobullet met een efficiënte intracellulaire afgifte, is een gedegen kennis van de biologie van cellulaire opname essentieel.

De epidermale groei factor receptor (EGFR) en de hepatocyte groei factor (HGF) receptor (Met) zijn tumor-gerelateerde, celmembraan gebonden receptor tyrosine kinases en daarom aantrekkelijke doelwitten voor therapie. EGFR dient al jaren als model receptor en de activatie en internalisatie van EGFR zijn goed bestudeerd. Ligand-geïnduceerde signalering van beide receptoren wordt geneutraliseerd door een negatieve-feedback mechanisme dat bestaat uit een snelle internalisatie en afbraak van het receptor-ligand complex. De internalisatie wordt gereguleerd door meerdere ligand-geïnduceerde post-translationele modificaties zoals fosforylering, ubiquitinering en acetylering. Deze modificaties verklaren de ligand-geïnduceerde internalisatie echter niet volledig. Sinds kort wordt er gesuggereerd dat de activatie-geïnduceerde clustering van EGFR op het plasmamembraan ook betrokken zou zijn bij internalisatie. Echter, het mechanisme van deze clustering-geïnduceerde internalisatie is nog onduidelijk.

In dit proefschrift wordt clustering-geïnduceerde internalisatie van EGFR en het mechanisme hierachter onderzocht met behulp van multi-epitoop-bindende antilichaam constructen gericht tegen het extracellulaire deel van EGFR (Hoofdstuk 3). EGFR clustering via biparatope VHHs (die twee niet-overlappende epitopen binden) resulteert in de internalisatie van het receptor-antilichaam complex via zogenaamde clustering-geïnduceerde, clathrine-gemedieerde endocytose (CIC-ME). CIC-ME is kinase-onafhankelijk en activeert de groei en proliferatieve signalering van tumor cellen niet. CIC-ME onthulde een voorheen onbekende rol van de transmembraan dimerisatie motieven van EGFR in internalisatie. EGFR clustering via tri-epitopische antilichaam-fibronectine constructen leidt vervolgens tot een onconventioneel, ubiquitine-onafhankelijk transport van EGFR richting lysosomale afbraak (Hoofdstuk 4).

De opgedane kennis omtrent kinase-onafhankelijke internalisatie en lysosomale transport in tumorcellen werd vervolgens toegepast bij de ontwikkeling van verschillende soorten internaliserende Nanobullets. Albumine nanodeeltjes werden gedecoreerd met nanobodies (NANAPs) voor de specifieke intracellulaire afgifte van de multi-kinase remmer 17864 in EGFR-positieve tumor cellen (Hoofdstuk 5). Lysosomale afgifte van 17864, door middel van een reversibele platinum-verbinding (Lx) tussen het albumine en 17864, zorgde voor remming van celdeling. Anti-Met NANAPs laten een soortgelijke internalisatie, lysosomaal transport en afbraak zien en kunnen beschouwd worden als een nieuw biomateriaal voor de intracellulaire afgifte van therapeutische moleculen in Met-positieve tumor cellen (Hoofdstuk 6). Ten slotte werden de nanobodies van de eerste internalisatie studies omgezet in Nanobullets voor fotodynamische therapie (PDT) door ze te koppelen aan de relatief hydrofiele photosensitizer (PS) IRDye700DX (Hoofdstuk 7). Na bestraling van deze PS met bijna infra-rood licht, vormt zich het zeer toxische NO2. Nanobody-PS-conjugaten laten een erg specifieke en hoge anti-tumor activiteit zien, die nog verder verbeterd wordt door internaliserende biparatope Nanobullets (100 % specifieke celdood met een IC50 van ~1 nM).

Samengevat, dit proefschrift (I) beschrijft het gebruik van nanobodies voor de behandeling van kanker tot dusver, (II) geeft inzicht in de fundamentele biologie achter clustering-geïnduceerde opname en transport in tumor cellen en (III) geeft drie voorbeelden van potentiële Nanobullets voor de behandeling van kanker. Door hun kleine formaat, de hoge specificiteit en hoge anti-tumor activiteit, zijn internaliserende nanobody-PS conjugaten de meest veelbelovende voorbeelden van Nanobullets die daardoor erg interessant voor verdere in vivo testen.