Philip Lossl

De titel van mijn proefschrift is een redelijk goede samenvatting van mijn onderzoek. Het doel is om verschillende “massaspectrometrie methoden” te combineren om zo karakterisering van “eiwitten” uit verschillende biologische systemen mogelijk te maken. Hierbij ligt een sterke focus bij de “structuren, modificaties en interacties” van deze eiwitten. Maar wat zijn eiwitten nou eigenlijk? Hoe helpt kennis over structuren, modificaties en interacties om eiwitten beter te kunnen begrijpen? En waarom is massaspectrometrie een nuttige techniek om eiwitten te karakteriseren? Voor ik de resultaten van mijn onderzoek beschrijf, zal ik eerst deze drie essentiële vragen beantwoorden.

Bijna elk proces in de levende natuur is gebaseerd op eiwitten. Hun diversiteit is al meteen zichtbaar als je kijkt naar de eiwitten die in deze proefschrift zijn onderzocht: sommigen spelen een rol in humane cel deling, anderen als receptor op het oppervlak van een cel om signaal eiwitten te herkennen, en nog anderen reguleren het dag en nacht ritme in blauwalgen. De “bouwplannen” voor al deze eiwitten liggen opgeslagen in onze genen. Echter, leven is niet alleen afhankelijk van deze bouwplannen maar wordt met name mogelijk gemaakt door de keuzes welke bouwplannen op welk moment worden uitgevoerd. Een dikkopje wordt een kikker, een rups wordt een vlinder, bladeren worden geel en rood in de herfst – in al deze gevallen blijft het geheel van genen (het genoom) onveranderd maar er wordt wel een specifieke set van genen actief. Met andere woorden: de metamorfosen die deze organismen ondergaan worden veroorzaakt door een verandering in de set van eiwitten die ze bezitten, ook wel het proteoom genoemd.

Om eiwitten te kunnen bouwen maken onze cellen gebruik van een set van 20 verschillende bouwstenen: de aminozuren. Hoeveel aminozuren en welke aminozuurvolgorde er nodig zijn om een eiwit te maken is beschreven in het genoom. Echter, losse keten van aminozuren maken nog geen eiwit. De ketens vouwen in allerlei complexe drie dimensionale structuren met zeer uiteenlopende vormen. Sommige eiwitten zijn erg langgerekt en kunnen stabiele netwerken vormen (bijvoorbeeld in bindweefsel). Anderen zien er weer uit als holle cilinders en vormen poriën in onze cel wanden. Nog weer anderen zijn constant in beweging, een beetje zoals mieren, om allerlei vracht te transporteren door onze cellen. Deze lijst, die nog veel verder kan worden uitgebreid, geeft duidelijk aan hoe de functie van een eiwit sterk beïnvloed wordt door zijn structuur.

De meeste eiwitten voeren hun functie niet alleen uit maar in samenwerking met andere eiwitten. Deze samenwerkingen kunnen tot stand komen door korte ontmoetingen maar ook door stabiele bindingen - hoe dan ook, eiwit-eiwit interacties liggen aan de basis. Om terug te gaan naar een eerder genoemd voorbeeld, een enkel eiwit kan misschien wel langgerekt zijn maar een stabiel netwerk ontstaat pas als meerdere van deze eiwitten een interactie hebben. De specifieke functies van de eiwitten in ons lichaam en hun aanleg om de corresponderende taken uit te voeren hangen daarom ook sterk af van hoe, waar en onder welke condities eiwitten interacties met elkaar hebben.

De brede term “condities” bevat een grote verscheidenheid aan omgevingsfactoren die onze cellen continue beïnvloeden. Om snel en efficiënt op deze factoren te kunnen reageren hebben cellen een set van mechanismen ontwikkeld. Een van de meest voorkomende mechanismen is de modificatie van eiwitten na hun productie (ook wel bekend onder de wetenschappelijke term translatie). Zulke “post-translationele modificaties” vinden meestal plaats op een specifieke set aminozuren en omvatten vaak de bevestiging van andere moleculen zoals fosfaten of suiker ketens. Deze modificaties kunnen fungeren als label, bijvoorbeeld om eiwitten naar specifieke locaties in een cel of een weefsel te laten transporteren. Daarnaast kunnen ze de structuur van een eiwit en de interacties met andere eiwitten sterk beïnvloeden.

De wisselwerking van deze drie factoren – structuur, interactie en modificatie – vormt de basis van een zeer complex netwerk dat in staat is om cellulaire processen op exact de juiste tijd en locatie plaats te laten vinden. We zijn nog mijlenver verwijderd van het compleet in kaart brengen van dit netwerk ondanks dat verscheidene gedeelten al in detail beschreven kunnen worden met technieken die gedurende de laatste jaren zijn ontwikkeld. Massaspectrometrie is de standaard methode geworden voor het bepalen van de aminozuursequentie van eiwitten. Om dit te doen, worden eiwitten eerst in kleine stukjes (peptiden) geknipt om vervolgens vanuit een oplossing naar de gas fase te worden gebracht als geladen deeltjes (ionen). In de massaspectrometer kunnen deze peptide ionen verder worden afgebroken in fragmenten en de massa van deze fragment ionen en peptide ionen zeer nauwkeurig worden bepaald. Omdat de massa’s van de fragment ionen karakteristiek zijn voor specifieke aminozuren of aminozuurcombinaties is het mogelijk om zo de aminozuursequentie van een peptide te bepalen. Bovendien, de gemeten massa’s van de fragment ionen laten duidelijke sprongen zien als bepaalde aminozuren post-translationele modificaties bevatten, waardoor hun locaties in een aminozuursequentie kunnen worden bepaald. Echter, deze traditionele aanpak, die ook wel bekend staat als bottom-up proteomics, geeft maar weinig inzicht in de structuur van een eiwit en zijn interacties met andere eiwitten. Daarom beschrijft deze proefschrift een set van massaspectrometrie methoden die op vergelijkbare principes zijn gebaseerd maar de wisselwerking van structuur, interactie en modificatie van eiwitten wel kan bestuderen.

De belangrijkste methoden die zijn toegepast in de thesis staan in detail beschreven in Hoofdstuk 1. Cross-linking massaspectrometrie werkt met het idee dat structuren van interacterende eiwitten kunnen worden gevangen met behulp van een chemisch web (een cross-linker). Vervolgens kan met massaspectrometrie worden bepaald op welke plekken de eiwitten door het web waren verbonden. De cross-linking reactie zal alleen plaats vinden tussen stukken van eiwitten die dicht bij elkaar liggen. Op die manier kan cross-linking massaspectrometrie informatie geven over de structuur van eiwitten en welke gedeelten van eiwitten betrokken zijn bij interacties. Een andere methode, ook wel bekend als top-down proteomics, gebruikt massaspectrometrie om de locatie van post-translationele modificaties in eiwitten in plaats van peptiden te bepalen. Dit maakt het bijvoorbeeld mogelijk om te onderzoeken hoeveel en in welke volgorde modificaties moeten worden ingebouwd om het functioneren van een eiwit te beïnvloeden. Een derde methode, natieve massaspectrometrie, is zelfs in staat om de massa van complete eiwitcomplexen te meten en zo eiwit-eiwit interacties te karakteriseren.

Natieve massaspectrometrie staat centraal in Hoofdstuk 2, dat de vereisten, limieten en voordelen van een hoge “massaresolutie” beschrijft. Massaresolutie is een maat voor de “scherpte” van gedetecteerde signalen. Een hoge massaresolutie stelt de massaspectrometer instaat om moleculen met een zeer klein massaverschil, of het nou moleculen met een grote of kleine massa zijn, van elkaar te onderscheiden. Een voorbeeld hiervan is twee eiwitcomplexen met identieke eiwitcomponenten die alleen verschillen in het aantal post-translationele modificaties. Met voldoende massaresolutie kunnen de verschillende modificatietoestanden van de eiwitcomplexen worden onderscheiden. Met een dergelijke analyse kan bepaald worden hoe de (aantal) modificaties de interacties tussen eiwitten beïnvloeden.

In Hoofdstukken 3 en 4 wordt onderzocht hoe een specifieke post-translationele modificatie (fosforylering) de structuur en interactie van de eiwitten Bora, Aurora-A en Plk1 beïnvloedt. Fosforylering is een chemische reactie waarbij enzymen (zogeheten kinases) de additie van een fosfaat groep aan een specifiek aminozuur, meestal serine of threonine, katalyseren. In het onderzochte eiwitsysteem vervullen Aurora-A en Plk1 de rol van kinases die niet alleen elkaar maar ook het eiwit Bora fosforyleren. Beide processen spelen een zeer belangrijke rol tijdens de voorbereiding van cellen op de celdeling.

In Hoofdstuk 3 worden de Aurora-A/Bora en Plk1/Bora interacties apart onderzocht. Door natieve massaspectrometrie te combineren met top-down proteomics en klassieke bottom-up proteomics wordt gevonden dat beide kinases Bora kunnen fosforyleren, hoewel dat gebeurt op verschillende plekken in het eiwit. Een meer gedetailleerde analyse van het Aurora-A/Bora systeem maakt bovendien duidelijk dat beide eiwitten een stabiel complex kunnen vormen ongeacht het aantal fosforyleringen die ze bevatten. Alles bij elkaar genomen suggereren de data ook dat fosforylering en complexformatie twee verschillende zijdes van de eiwitinteractie tussen Aurora-A en Bora vormen.

Hoofdstuk 4 richt zich op de drieledige interactie tussen Bora, Aurora-A en Plk1. Aan de methoden uit Hoofdstuk 3 worden nu ook cross-linking massaspectrometrie en natieve ionenmobiliteit-massaspectrometrie toegevoegd. Deze laatste methode is een variant van natieve massaspectrometrie die naast de massa ook de vorm (gemiddelde diameter) van een eiwit kan bepalen. De cross-linking en natieve massaspectrometrie bevestigen dat Aurora-A en Bora constant een interactie met elkaar hebben. Bora en Plk1 echter, krijgen pas een interactie met elkaar als Bora voldoende gefosforyleerd is. Natieve ionenmobiliteit-massaspectrometrie laat bovendien zien dat deze maat van fosforylering gepaard gaat met een verandering van de vorm van Bora. Dit houdt in dat fosforylering van Bora leidt tot een meer compacte vorm van het eiwit die beter in staat is een interactie aan te gaan met Plk1. Tenslotte laat de combinatie van top-down en bottom-up proteomics zien welke aminozuren worden gefosforyleerd en in welke volgorde de modificaties plaats vinden voor, tijdens en na de vormverandering van Bora. Samen genomen bieden de vijf verschillende massaspectrometrie methoden de mogelijkheid om de wisselwerking tussen fosforylering, structuurverandering en eiwit-eiwit interacties van Bora, Aurora-A en Plk1 bloot te leggen.

Terwijl de voorgaande Hoofdstukken een sterke massaspectrometrie focus hadden, gaat Hoofdstuk 5 dieper in op de combinatie van massaspectrometrie met ander methoden voor eiwitkarakterisatie. Als voorbeelden hiervan worden de onderzoeken naar de humane LRPN receptor en het KaiCBA eiwitcomplex uit blauwalgen beschreven.

LRPN is het grootste eiwit in de LDL receptor familie. Het is betrokken in verschillende biologische processen, waaronder het in stand houden van de bloed-hersenbarrière. In zijn rol als receptor kan LRPN verschillende signaeleiwitten (liganden) op het oppervlak van de cel binden. Verschillende gedeeltes van LRPN zijn erg mobiel en flexibel, wat het moeilijker maakt de eiwitstructuur te definiëren en de ligandbindende gedeelten te onderzoeken. De experimenten in dit Hoofdstuk zijn gericht op de karakterisatie van de structuur en ligand bindingcapaciteit van LRPN door middel van een combinatie van natieve massaspectrometrie en cross-linking massaspectrometerie met klassieke biochemische en biofysische technieken zoals oppervlakteplasmonenresonantiespectroscopie, electronenmicroscopie en kleine-hoekverstrooiing van röntgenstraling. Uit de resultaten blijkt dat LRPN een langgerekte vorm heeft en één of twee liganden bindt in een omgeving met een neutrale pH. Echter, in meer zure omgevingen, die ook bestaan in onze cellen, krijgt LRPN een meer compacte vorm en worden de interacties met de liganden verstoord. Deze observaties geven zo meer inzicht in de moleculaire basis waarop de LRPN receptor liganden bindt, transporteert en weer los laat.

Een trio van eiwitten genaamd KaiC, KaiB en KaiA vormen de bouwstenen voor de biologische klok in blauwalgen (cyanobacterien), een groep fotosynthetische bacterien verantwoordelijk voor de productie van een groot gedeelte van de zuurstof in onze atmosfeer. Door middel van interacties tussen de drie eiwitten wordt het bioritme van de blauwalg aangepast aan het dag en nacht ritme op aarde. Vergelijkbaar met de tandwielen in een klok volgen KaiC, KaiB en KaiA een 24 uur durende cyclus van interactie en scheiding. Met behulp van natieve massaspectrometrie kan het ontstaan en weer verdwijnen van de KaiCBA complexen worden gevolgd gedurende de dag. Daarnaast, en misschien nog wel belangrijker, kan natieve massaspectrometrie precies vertellen op welk tijdstip de biologische klok staat en wanneer een volledig KaiCBA complex aanwezig is. De structuur van dit volledige KaiCBA complex kan zeer gedetailleerd worden opgehelderd (tot het atomisch niveau) met behulp van cryo-electronenmicroscopie. Deze structuur, na validatie met andere technieken zoals cross-linking massaspectrometrie, laat precies zien op wat voor manier de drie Kai eiwitten een interactie met elkaar hebben. Door deze informatie toe te voegen aan de data van de ritmische interacties van de verschillende KaiCBA complexen verkregen met natieve massaspectrometrie ontstaat een zeer compleet beeld over hoe blauwalgen de tijd bij houden.

Al de bovengenoemde voorbeelden illustreren goed hoe de functies van veel eiwitten sterk worden beïnvloed door een wisselwerking van interacties, post-translationele modificaties en structurele veranderingen. Ondanks dat massaspectrometrie zeker niet de allround techniek is om deze complexe netwerken te onderzoeken, kan het erg veel toevoegen aan hun ontrafeling. Een belangrijke overeenkomst van al de toegepaste massaspectrometrie methoden is dat ze de mobiliteit en dynamiek van de eiwit structuren en interacties weten te vangen, en eiwitten niet zomaar zien als passieve, statische entiteiten. Dit kan de interpretatie van de data moeilijker maken, zeker als maar een enkele methode wordt gebruikt. Echter, door gebruik te maken van meerdere verschillende massaspectrometrie methoden en ze te combineren met andere biochemische en biofysische methoden kunnen de behaalde resultaten worden gecontroleerd en zelfs tot dieper inzicht leiden. Korter gezegd: vele (analytische) handen maken licht werk! Toch blijft aan ons de taak om keer op keer te kiezen welke handen er nodig zijn om de beste grip (op de situatie) te krijgen. Dat dit de moeite waard is wordt niet alleen gedemonstreerd in deze proefschrift maar ook door vele voorgaande onderzoeken in eerdere jaren waarin immens complex biologische processen tot in (atomisch) details zijn bestudeerd. De slimme combinatie van complementaire methoden is dus duidelijk niet de snelste maar misschien wel de meest veelbelovende route naar een beter begrip van de moleculaire mechanismen van het leven.