Navina Chrobok

Multiple Sclerose (MS) is een ontstekingsziekte van het centraal zenuwstelsel (CZS) die wordt gekenmerkt door demyelinisatie en axonale schade. Het is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen bij jonge volwassenen. MS veroorzaakt ernstige lichamelijke handicaps in combinatie met cognitieve stoornissen, die de kwaliteit van leven sterk beïnvloeden. De meest voorkomende vorm van MS uit zich pathologisch door een massale migratie van leukocyten vanuit de bloedbaan naar het CZS, gefaciliteerd door functionele verstoringen van de bloed-hersenbarrière. Deze geïnfiltreerde cellen beschadigen, samen met geactiveerde residente cellen van het CZS, de isolerende myelineschede van de axonen en zijn verantwoordelijk voor de ernstige invaliderende symptomen bij MS-patiënten.

Helaas is er tot op heden geen preventieve of genezende behandeling beschikbaar en de therapie voor MS past traditioneel een algemene ontstekingsremmende behandeling toe. In de afgelopen jaren is er een specifiekere aanpak toegepast, die gericht is op de instroom van CZS-infiltrerende lymfocyten. Met dit doel in gedachten is een gedetailleerd begrip van de celtypen en mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese van MS van cruciaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen, mogelijk met minder bijwerkingen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat monocyten en/of macrofagen een nadelige invloed hebben in het vroege stadium van de pathogenese van MS en in het bijbehorende diermodel experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE). Bovendien vormen zij de meerderheid van de geïnfiltreerde immuuncellen in de CZS-laesies. Tot nu toe zijn monocyten/macrofagen niet specifiek het doelwit van therapeutische geneesmiddelen die beschikbaar zijn bij MS. Om meer kennis te verkrijgen over de pathogenese van MS wordt onderzoek vaak gedaan met experimentele modellen die bepaalde aspecten van de ziekte nabootsen. In dit proefschrift hebben we EAE-modellen bij knaagdieren gebruikt, de meest gebruikte modellen voor het bestuderen van neuro-inflammatoire processen zoals aanwezig in de pathologie van MS.

Tissue Transglutaminase (TG2) is een multifunctioneel enzym uit de Transglutaminase-familie. Het is het meest bekend om zijn enzymatische eiwit-crosslinking activiteit, maar vertoont daarnaast diverse andere enzymatische functies, waaronder GTPase, disulfide-isomerase en proteïnekinase activiteit, evenals enzymatisch onafhankelijke functies. TG2 is geassocieerd met belangrijke functies in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden en komt alomtegenwoordig tot expressie in vele celtypen, waaronder monocyten en macrofagen. Het enzym is voornamelijk aanwezig in het cytoplasma, maar is ook aangetroffen in de celkern, mitochondriën, het endoplasmatisch reticulum, op het celoppervlak en extracellulair in de extracellulaire matrix (ECM). Verhoogde TG2-expressie en transamidatie-activiteit wordt vaak waargenomen onder inflammatoire omstandigheden en TG2 kan bijdragen aan vele fundamentele processen, waaronder cellulaire adhesie en migratie, cytoskeletale herschikking en celdifferentiatie. Eerder onderzoek vond zowel neuro-inflammatie als degeneratie gefaciliteerd door ontregelde expressie en activiteit van TG2 in verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington.

De studies in dit proefschrift waren gericht op het identificeren van de cellulaire expressie van TG2 in post-mortem CZS-materiaal van MS-patiënten en van knaagdieren onderworpen aan EAE. Om de rol van TG2 in de ontwikkeling van EAE-symptomen en pathologie op te helderen, onderzochten we de bijdrage en het potentieel van TG2 als aangrijpingspunt voor geneesmiddelen in EAE bij de rat en de muis.

Onze immunohistochemische studies toonden aan dat TG2 tot expressie komt in inflammatoire witte stof MS-laesies in post-mortem CZS-weefsel van MS-patiënten (hoofdstukken 2 en 3) en in EAE-laesies van ratten (hoofdstuk 2) en muizen (hoofdstukken 4 en 5). In beide pathologieën, onder de conditie van inflammatoire activiteit in de laesies, leken cellen TG2 tot expressie te brengen en werden ze geïdentificeerd als leukocyten en meer specifiek macrofagen. De beperking van TG2-expressie tot specifieke celtypen die belangrijke spelers zijn in de ziektepathologie van MS en EAE geeft aan dat TG2 betrokken kan zijn bij beide ziektepathologieën, wat TG2 een potentieel boeiend therapeutisch doelwit maakt. Interessant genoeg vonden we bewijs dat TG2-upregulatie in monocyten in EAE mogelijk al plaatsvindt voorafgaand aan hun extravasatie in het CZS-parenchym. De upregulatie van TG2 in perifere monocyten zou dan heel goed een opmaat kunnen zijn naar verdere betrokkenheid van TG2 in de pathologie van MS en EAE.

Hoewel post-mortem weefsel waardevolle informatie verschaft over CZS-laesies van MS en EAE, voegt het in beeld brengen van de interactie met monocyten in het ruggenmerg meer gedetailleerde informatie toe over het gedrag van monocyten tijdens EAE in vivo. In hoofdstuk 4 bestudeerden we het gedrag van kruipende, fluorescerende monocyten en hun interactie met het endotheel van het ruggenmerg in EAE-muizen, in real-time met behulp van 2-fotonmicroscopie. De cellen werden gevisualiseerd in CX3CR1-transgene muizen, waarin monocyten, macrofagen en microgliacellen groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen. We toonden aan dat de hoeveelheid kruipende cellen is toegenomen en hun baanlengtes verlengd tijdens EAE, wat wijst op een potentieel stevigere interactie van de cellen met het endotheel. Een van de mediatoren van deze processen zou TG2 kunnen zijn, waarvan de expressie in aan het hersenendotheel gehechte monocyten werd bevestigd in post-mortem weefsel van deze transgene muizen.

Om een mogelijke causale bijdrage van TG2 aan de ontwikkeling van EAE-motorsymptomen en pathologie te onderzoeken, hebben we de TG2-activiteit farmacologisch gemanipuleerd in EAE-modellen bij knaagdieren (hoofdstukken 2 en 5). Ratten en muizen lijdend aan EAE werden behandeld met verschillende TG2-remmende verbindingen net na het ontstaan van de ziektesymptomen. De farmacologische remming van de TG2-activiteit kon de motorsymptomen en de pathologie van EAE drastisch verminderen, wat een rol voor TG2 bij de ontwikkeling van EAE-symptomen bevestigt. Vooral de toediening van één verbinding (KCC009) verminderde sterk de infiltratie van leukocyten in het CZS en de vorming van laesies. Samen met in vitro reductie van monocytenadhesie aan en migratie over bloed-hersenbarrièrecellen na TG2-remming, wijst dit in de richting van door monocyten en macrofagen geproduceerd TG2 dat een rol speelt in hun in vivo kruipgedrag langs de bloedvaten in het CZS als een eerste stap naar CZS-infiltratie. Veelbelovend voor een mogelijke behandeling van MS met TG2-remmers is dat een therapeutische behandelingsaanpak na het begin van de ziektesymptomen, vergelijkbaar met de behandeling van MS-patiënten, effectief is. Hoewel de toediening van TG2-activiteitsremmers duidelijke gunstige effecten liet zien in onze diermodellen, zijn het gedetailleerde proces en de mechanismen nog niet volledig opgehelderd. We namen een beter effect waar bij het gebruik van een TG2-remmer die de cellen niet binnendringt, wat wijst op een belangrijke rol voor oppervlakte/extracellulair TG2 bij het verminderen van EAE-symptomen en met name de CZS-infiltratie van immuuncellen. Daarom is het waarschijnlijk dat een samenspel van de transamidatiefunctie van TG2 en mogelijk andere acties van TG2, die niet specifiek in deze context zijn bestudeerd, betrokken zijn bij de pathologie van EAE en de ontwikkeling van symptomen.

Concluderend tonen onze studies aan dat TG2 tot expressie komt in monocyten en macrofagen in inflammatoire MS- en EAE-laesies. Onze bemoedigende resultaten van farmacologische TG2-remming bij knaagdieren lijdend aan EAE onthulden dat TG2 betrokken is bij de migratie van monocyten/macrofagen naar het CZS. Bovendien draagt TG2 bij aan de motorische beperking in EAE en vandaar dat TG2 een potentieel interessant doelwit zou kunnen zijn voor MS-patiënten. De hier gepresenteerde studies ondersteunen het onderzoek naar door monocyten en macrofagen geproduceerd TG2 als een potentieel druggable target van belang voor de behandeling van MS-patiënten.