Na Yu

Samenvatting en evaluatie van de doelstellingen

Toename van kennis in de medische wetenschap heeft geleid tot een hogere levensverwachting, en dus tot veroudering van de bevolking. Tegelijkertijd hecht men steeds meer waarde aan het behoud van het natuurlijke gebit. De genoemde veroudering gaat echter juist gepaard met een toename van parodontale problemen, welke uiteindelijk kunnen resulteren in het verlies van tanden en kiezen. Dientengevolge ontstaat er binnen de tandheelkunde de noodzaak tot het vinden van een effectieve oplossing van dit probleem, dwz. het vinden van een betrouwbare regeneratieve therapie om beschadigde parodontale weefsels te kunnen herstellen tot aan de originele toestand. Het bewerkstelligen van parodontale regeneratie wordt op dit moment op verschillende manieren geprobeerd, onder andere door het schoonmaken van het tandworteloppervlak en GTR. Alle genoemde aanpakken hebben echter hun beperkingen en zijn tot dusverre niet in staat om volledige regeneratie te bewerkstelligen. Naar aanleiding van recente ontwikkelingen in de vakgebieden van celbiologie en biomaterialen, zou een aanpak die leidt tot het bereiken van volledige parodontale regeneratie ontwikkeld kunnen worden. Het combineren van cellen met de signaalmoleculen en dragermaterialen zou een regeneratiestrategie kunnen zijn die zorgt voor de ontwikkeling van weefsel met de juiste organisatorische en temporele eigenschappen, en die wel compleet parodontaal herstel mogelijk maakt. Het doel van het huidige proefschrift was om een dergelijke weefselregeneratiestrategie voor het parodontium te onderzoeken, specifiek gebaseerd op cellen. In hoofdstuk 1 wordt een bondige algemene inleiding geschetst over parodontale weefselregeneratie, en worden vervolgens de hoofddoelstellingen van het proefschrift beschreven. Vervolgens behandelt elk hoofdstuk een eigen onderzoeksvraag. Deze behandelt de vragen uit het eerste hoofdstuk, achtereenvolgens:

1. Wat is de huidige stand van zaken op het gebied van dragermaterialen en preklinische modellen in het vakgebied van tandheelkundige weefselregeneratie?

Het vermogen van de mens om verloren gegaan tandweefsel te kunnen herstellen is zeer beperkt. Dankzij het toegenomen begrip over het proces van wondheling, en toegenomen kennis in de vakgebieden materiaalkunde en moleculaire biologie, lijkt het op dit moment mogelijk te worden om zelf specifieke tandheelkundige weefsels, of zelfs een hele tand, te gaan maken. Dientengevolge verschuift het paradigma voor tandheelkundige behandelingen. Voordat een biologische oplossing vertaald kan worden tot een praktisch toepasbaar regeneratief product, moet een dergelijk geavanceerd biomateriaal getest worden in een geschikt diermodel. In hoofdstuk 2 wordt een overzicht gepresenteerd van de dragermaterialen die op dit moment worden toegepast bij tandheelkundige weefselregeneratie, samen met de gebruikte klinische modellen waarin dergelijke materialen getest worden. De meest voorkomende dragermaterialen en modellen worden ingedeeld op basis van de gevolgde behandelstrategie: regeneratie van het dentale pulpa complex, het periodontium, of het alveolaire bot. Gebaseerd op de onderzoekservaring worden tenslotte een aantal richtlijnen voor het ontwerpen van een succesvolle experimentele opzet gegeven, en worden toekomstige ontwikkelingen in dit veld toegelicht.

2. Leidt het implanteren van parodontaal ligament cellen tot verbeterde regeneratie in een maxilla parodontaal defect model in de rat?

Als gevolg van het beperkte regeneratieve vermogen leiden huidige behandelingen van parodontale defecten niet altijd tot een voldoende bevredigend klinisch resultaat. In eerdere studies is het implanteren van een construct, bestaande uit cellen en een biomateriaal als drager, voorgesteld als een klinisch haalbare aanpak. Hoofdstuk 3 had tot doel om te onderzoeken welke bijdrage geïmplanteerde parodontaal ligament (PDL) cellen kunnen leveren aan parodontale regeneratie. Om dit te onderzoeken werden gelatinesponsjes geladen met PDL cellen of, als controle cellen, gingivale fibroblasten (GF), die GFP-gelabeld waren, geïmplanteerd in een chirurgisch gemaakt parodontaal botdefect in een rat. Na 6 weken werden de bovenkaken gedecalcificeerd en gebruikt voor histomorphometrische en immunohistochemische analyse. Wanneer PDL cellen geïmplanteerd waren, werd er in de dieren significant meer functioneel bot en ligament gevormd. Vervolgens waren er ook opmerkelijke verschillen zichtbaar in de verdeling van de getransplanteerde cellen. De PDL cellen lagen altijd direct aangrenzend aan geregenereerde gebieden. In scherp contrast lagen GF cellen verspreid over het hele wondgebied, en werd in deze groep geen effect op parodontale weefselregeneratie gevonden. Gebaseerd op deze resultaten werd geconcludeerd dat PDL cellen na transplantatie in een parodontaal defect kunnen overleven en vervolgens regeneratie van het parodontium kunnen bevorderen, waarschijnlijk doordat deze cellen factoren afgeven die inwerken op de directe omgeving.

3. Wat is de rol van geïmplanteerde PDL cellen in het proces van parodontale regeneratie?

Transplantatie van PDL cellen vormt een beloftevolle strategie voor parodontale regeneratie. Er is echter weinig bekend over de exacte functie van de PDL cellen na transplantatie. In hoofdstuk 4 werd een combinatie van in vitro cokweeksystemen en in vivo immunohistochemie gebruikt om de rol van PDL cellen in het proces van regeneratie te onderzoeken. Wanneer mesenchymale cellen in een cokweek direct in contact gebracht werden met PDL cellen, nam de vorming van gemineraliseerde matrix en de mRNA expressie van het osteogene gen osteocalcine significant toe. Het toevoegen van GF leidde daarentegen tot een afname in expressie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij het toepassen van een cokweeksysteem waarin de cellen werden gescheiden door middel van een membraan, en er dus geen direct celcontact mogelijk was. In een in vivo ratmodel werd regeneratie van alveolair bot en parodontaal ligament gezien na PDL transplantatie. De geïmplanteerde PDL cellen werden geclusterd en aangrenzend aan (maar niet binnen in) het nieuw gevormde weefsel teruggevonden. Vervolgens werd immunohistochemisch een verhoogde expressie van osteopontine en gap junctions aangetoond in de gebieden aangrenzend aan de geïmplanteerde PDL cellen. Concluderend tonen deze resultaten aan dat PDL cellen in staat zijn om het proces van parodontale regeneratie te stimuleren door het afgeven van een trofische factor die in staat is om botvorming te stimuleren in het omliggende weefsel van de gastheer.

4. Wat is de invloed van mechanische belasting op PDL cellen in een driedimensionaal (3D) celkweeksysteem?

Parodontitis is een aandoening die de ondersteunende structuren van de tand aantast, en zo uiteindelijk kan leiden tot tandverlies. In hoofdstuk 5 werd een 3D weefselkweekmodel ontwikkeld, waarin uiteindelijk transplanteerbare constructen voor parodontale defecten gekweekt zouden kunnen worden. Tegelijkertijd is een dergelijk model ook geschikt om in vitro experimenten uit te voeren en zo bijvoorbeeld de effecten van mechanische belasting te bestuderen. In dit onderzoek werden GFP-gelabelde PDL cellen van rat-incisieven ingesloten in een 3D matrix en vervolgens blootgesteld aan mechanische belasting, al dan niet in combinatie met een chemische stimulus (Emdogain; EMD). De mechanische belasting bestond uit unilaterale rek (8%, 1 Hz) die werd toegepast gedurende 1, 3, of 5 dagen. De resultaten lieten zien dat cellen tijdens een onbelaste kweek willekeurig verspreid lagen in de kunstmatige PDL matrix, en geen voorkeur voor een bepaalde oriëntatie vertoonden. Mechanische belasting leidde tot een verhoogd aantal cellen, terwijl daarnaast de cellen van oriëntatie veranderden. De cellen gingen, afhankelijk van de tijd en de positie, in een richting liggen die loodrecht op de richting van de belasting lag, net zoals dit bij een natuurlijk PDL het geval is. Het toevoegen van EMD leidde tot een significant effect op de groei van PDL cellen, en tot een verhoogde expressie van de genen BSP en Col-I, terwijl Runx-2 naar beneden werd gereguleerd. Een combinatie van chemische en mechanische belasting was ook mogelijk, maar daarbij traden geen synergetische effecten op. In conclusie werd in dit hoofdstuk dus een nieuw model geïntroduceerd voor onderzoek naar PDL-gerelateerde regeneratie. Behalve dat dit 3D model gevalideerd werd om het natuurlijke PDL zo betrouwbaar mogelijk na te bootsen, kon in deze gecontroleerde aanpak het celgedrag onder invloed van mechanische belasting en andere stimuli bestudeerd worden.

5. Hoe wordt het gedrag van PDL cellen beïnvloed door het toepassen van multi-factoriële stimuli; een substraat met nanotextuur in combinatie met mechanische vervorming?

PDL cellen spelen een belangrijke rol in het remodelleren van botweefsel en bij het vormen van ligament rond de tand. In deze processen zijn de mechanische belasting op en de specifieke omgeving van de cellen nauw betrokken. De meeste in vitro celkweekexperimenten laten de mechanische belasting en structurele aspecten van het substraat echter buiten beschouwing, of bestuderen deze aspecten onafhankelijk van elkaar, en representeren daarmee de natuurlijke micro-omgeving van het PDL dus niet erg nauwkeurig. Daarom werd in hoofdstuk 6 de invloed van gecombineerde mechanisch-topografische stimuli bestudeerd op de morfologie, proliferatie en bot- of ligamentdifferentiatie. Humane PDL cellen werden gezaaid op een substraat met een nanometrisch oppervlakte-groefpatroon en vervolgens blootgesteld aan een periode van 2 dagen cyclische belasting. Celmorfologie werd bepaald met een fluorescente kleuring. Verder werd de totale hoeveelheid DNA en de mRNA expressie van osteogene (transcriptiefactor Runx2, osteocalcine) en ligament-gerelateerde (transcriptiefactor scleraxis, elastine) genen bepaald. Gezien werd dat de PDL cellen hun vorm aanpasten volgens de nanometrische textuur en altijd parallel lagen aan het groefpatroon. Wanneer cellen werden blootgesteld aan mechanische belasting verloren zij echter hun initiële voorkeursoriëntatie zoals geïnduceerd door het nanopatroon. Bij dergelijke dubbele stimulatie werd na 3 dagen meer totaal DNA gemeten. Verder werd er een significant en verhogend effect op de expressie van Runx2 gemeten in deze gecombineerde groep. Voor de merkergenen gerelateerd aan het ligament, scleraxis en elastine, werd gezien dat de expressie toenam bij mechanische belasting, terwijl deze juist afnam bij een oppervlak met een nanopatroon. In conclusie lieten de resultaten dus zien dat mechanische stimulatie een cruciale factor is die parodontaal celgedrag beïnvloeden kan door het veranderen van de activiteit van osteogene en ligamentgenen. Nanostructuur kan gebruikt worden om de structuur van natuurlijke extracellulaire matrix na te bootsen en leidt eveneens tot verschillende effecten op PDL celmorfologie en genexpressie.

Afsluitende opmerkingen en toekomstperspectief

Dit proefschrift wilde meer inzicht verschaffen in het proces van regeneratie rond het parodontium. Om dit doel te bereiken werden er twee verschillende onderzoeksstrategieën gevolgd. Ten eerste werd in een diermodel de transplantatie van cellen afkomstig uit het PDL onderzocht. Ten tweede werd een meer fundamentele aanpak gevolgd, waarbij verschillende in vitro modelsystemen werden ontwikkeld die tot meer begrip kunnen leiden over de invloed van mechano-topografische stimuli op het gedrag van de PDL cellen. De resultaten van de in vivo celimplantatiestudies lieten zien dat PDL celtransplantatie parodontale regeneratie bevordert, maar op een indirecte manier. De bijbehorende in vitro cokweek en in vivo immunohistochemische studies lieten zien dat PDL cellen het proces van botvorming bevorderen door het afgeven van stimulerende factoren op cellen in de directe omgeving. Zulke paracriene effecten zijn als het kritische proces te beschouwen waarmee PDL cellen in staat zijn een superieure weefselregeneratie te veroorzaken. Daarnaast werd een hogere expressie van gap junctions gevonden in de gebieden waar celtransplantatie had plaatsgevonden, wat er op wijst dat er ook een intensievere uitwisseling plaatsvindt van kleine boodschappermoleculen tussen de geïmplanteerde PDL cellen en de gastheercellen in de directe omgeving.

Naast het diermodel werd ook een meer fundamentele onderzoeksrichting vervolgd. Aangezien het parodontium gekenmerkt wordt door een hoge graad van organisatie en zich onder voortdurende mechanische belasting bevindt, werd verondersteld dat mechano-topografische stimuli net zo belangrijk zijn in het regeneratieve proces als mediërende eiwitfactoren. Gebruikmakend van een zeer gecontroleerd 3D weefselkweekmodel werd aangetoond dat PDL cellen van richting kunnen veranderen na mechanische stimulatie. De cellen veranderden hun oriëntatie ten gunste van de mechanische belasting, zelfs nadat zij eerst waren gekweekt op een substraat voorzien van een nanopatroon dat juist bepalend was voor celmorfologie onder onbelaste omstandigheden. Een dergelijk fenomeen is zeer waarschijnlijk een goede afspiegeling van het natuurlijke proces van ligamentvorming. Tijdens de allervroegste fase van regeneratie bestaat er geen organisatie in de omgeving van de PDL cellen. Dit belet de PDL cellen dan ook om op een geordende wijze collagene vezels te vormen. Tijdens het regeneratieve proces reageren de cellen echter actief op de mechanische belasting en gaan zich daardoor herschikken. Vervolgens produceren deze cellen dan ook extracellulaire matrix in een bepaalde voorkeursrichting om op die manier de mechanische belasting te kunnen weerstaan. Als direct gevolg van de mechanische belasting verandert de oriëntatie van de PDL vezels van chaos naar orde. Alleen de vezels die afgezet zijn op de correct georganiseerde manier zijn in staat mechanische belasting efficiënt over te dragen.

De theoretische voorspellingen vanuit het in vitro model komen nauw overeen met de bevindingen van de in vivo PDL celimplantatiestudie. Naast de vorming van harde weefsels werd ook de vorming van nieuw ligament gevonden in een parodontaal defectmodel in de rat. Aangezien de vorming van nieuw en correct georganiseerd ligament altijd gepaard gaat met botvorming, kan er zelfs gehypothetiseerd worden dat de vorming van hard weefsel een randvoorwaarde is voor ligamentvorming. Alleen na de vorming van het botweefsel is er namelijk de mogelijkheid dat er mechanische belasting kan plaatsvinden, uiteindelijk resulterend in de hierboven beschreven vorming en ordening van de collagene bundels in een bepaalde voorkeursrichting.

Op dit moment blijft de vraag over hoe nu met een weefselregeneratiestrategie gebaseerd op celtransplantatie verder te komen tot aan een breed toepasbare aanpak in de klinische praktijk. Om dit mogelijk te maken zullen eerst een aantal beperkingen en vervolgonderzoeken moeten worden onderkend. Ten eerste is het belangrijk om te realiseerden dat alle bevindingen over parodontale weefselregeneratie tot dusverre gedaan zijn in celkweek en dierstudies, die natuurlijk niet altijd direct vertaalbaar zijn naar de menselijke situatie. Dit proefschrift focusseerde voornamelijk op het gedrag van PDL cellen in een gecontroleerd, maar chirurgisch veroorzaakt parodontaal defectmodel. De invloed van een natuurlijk aangedane anatomie, en daarbij ook de microbiële omgeving, op het proces van regeneratie blijft vooralsnog onopgelost. In de toekomst zullen er alternatieve parodontale defectmodellen ontwikkeld en gebruikt moeten worden die meer lijken op de uitdagende klinische situatie, bijvoorbeeld modellen die horizontaal botverlies nabootsen samen met de juiste omgevingsfactoren (aanwezigheid van de betrokken micro-organismen).

Ten tweede zal het klinisch toepassen van autologe PDL cellen lastig zijn door de beperkte aanwezigheid van deze celbron. In de praktijk is het niet alleen gecompliceerd om voldoende gezonde cellen te verkrijgen van patiënten met een parodontale aandoening, maar het is ook lastig om PDL cellen te verkrijgen zonder het extraheren van een element. Het is bekend dat stromale cellen uit het beenmerg over het vermogen beschikken om naar meerdere fenotypen te differentiëren. Toekomstig onderzoek zou dus kunnen beschouwen of het gebruik van dit celtype klinisch eerder haalbaar zal zijn voor gebruik in parodontale weefselregeneratie.

Ten derde zijn de signaalmoleculen waarmee de getransplanteerde cellen specifieke weefselregeneratie kunnen bewerkstelligen nog grotendeels onbekend. Er is vervolgonderzoek nodig om de cellulaire en moleculaire processen op te helderen die betrokken zijn bij de restauratie van verloren gegaan parodontaal weefsel voordat een betrouwbare biologische therapie ontwikkeld kan worden. Alleen wanneer de overspraak tussen de geïmplanteerde cellen en de cellen van de gastheer zorgvuldig ontrafeld is, kan parodontale weefselregeneratie waarschijnlijk eenvoudiger en meer effectief worden toegepast, door dan alleen nog dragermaterialen te gebruiken die voorzien zijn van alle complexe biologische signalen, en daarmee de gastheercellen aan kunnen sturen zonder dat implantatie van exogene cellen nodig is.

Het lijkt duidelijk dat de huidige behandelopties voor het bereiken van volledig parodontaal herstel niet ideaal zijn en dat de techniek van weefselregeneratie potentieel heeft om een dergelijk doel wel te bereiken. Het is nodig vele eigenschappen te beschouwen zoals de keuze van de cellen, signalen en matrix, allen in de juiste temporele en ruimtelijke volgorde. Voordat parodontale regeneratie op deze wijze geschikt is voor klinische toepassing moeten er echter nog vele horden genomen worden, en is eerst meer begrip nodig van de onderliggende cellulaire processen. Geavanceerde celkweekmodellen die meerdere lokale aspecten van het natuurlijk weefsel nauwkeurig kunnen nabootsen, kunnen een belangrijke rol spelen bij het verkrijgen van dergelijk begrip.