Martijn de Roij

De overgang van het leven in water naar land vormt een van de meest ingrijpende evolutionaire gebeurtenissen in de geschiedenis van de aarde. Ongeveer 600 miljoen jaar geleden koloniseerden de voorouders van de huidige landplanten terrestrische habitats die aanvankelijk vijandig en grotendeels onbewoonbaar waren. Het succesvol koloniseren van deze leefomgevingen vereiste dat deze vroege planten nieuwe ontwikkelingsmechanismen evolueerden om met nieuwe omgevingsfactoren om te gaan. Het overwinnen van deze uitdagingen vereiste steeds complexere meercellige lichaamsstructuren, wat op zijn beurt de ontwikkeling van geavanceerde regulatoire netwerken noodzakelijk maakte die groei, cel differentiatie en reactie op omgevingssignalen konden coördineren.

Centraal in de regulatie van plantontwikkeling staat het fytohormoon auxine, een signaalmolecuul dat een breed scala aan processen in planten aanstuurt, waaronder embryogenese, orgaanvorming, regeneratie en aanpassing aan de omgeving. Auxine fungeert als een positioneel signaal dat patroonvorming in weefsels, cellulaire identiteit en de timing van ontwikkelingsprocessen stuurt. Ondanks dat het chemisch gezien een relatief eenvoudig molecuul is, coördineert auxine een grote diversiteit aan ontwikkelingsprocessen gedurende de volledige levenscyclus van planten. Begrijpen hoe auxine deze complexe ontwikkelingsprocessen aanstuurt vormt daarom een grote, centrale vraag binnen de plantenbiologie.

Auxinesignalering in landplanten wordt voornamelijk gemedieerd via de Nuclear Auxin Pathway (NAP), een transcriptioneel moleculair systeem dat veranderingen in intracellulaire auxineconcentraties vertaalt naar specifieke veranderingen in genexpressie. Cruciale componenten van de NAP zijn de AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) transcriptiefactoren, die binden aan DNA-elementen en reguleren daardoor de transcriptie van auxine-responsieve genen. Hun activiteit wordt beïnvloed door Aux/IAA remmer-eiwitten, die ARF-activiteit remmen in afwezigheid van auxine. Wanneer auxineniveaus toenemen, stimuleert auxine de interactie tussen Aux/IAA-proteïnen en het TIR1/AFB-receptorcomplex, wat leidt tot afbraak van Aux/IAA-proteïnen via het 26S proteasoom. Het verwijderen van deze remmende Aux/IAA-proteïnen heft de repressie van ARF-transcriptiefactoren op, waardoor activatie van auxine-responsieve genexpressie mogelijk wordt.

Hoewel dit canonieke model een robuust kader vormt voor het begrijpen van auxinesignalering, en gedurende de afgelopen drie decennia grotendeels onveranderd is gebleven, beschouwt het ARF transcriptiefactoren grotendeels als statische componenten van de NAP waarvan de hoeveelheid voornamelijk wordt bepaald door genexpressie. De activiteit van een transcriptiefactor wordt echter sterk beïnvloed door zijn abundantie, en deze kan bijvoorbeeld worden gereguleerd via transcriptie van het corresponderende gen. Transcriptieregulatie op zichzelf maakt echter geen snelle verlaging van eiwitniveaus mogelijk. Daarvoor zijn aanvullende regulatoire mechanismen noodzakelijk. Toenemend bewijs, waarvan een groot deel in dit proefschrift wordt gepresenteerd, suggereert dat ARF-proteïnen zelf eveneens worden gereguleerd via proteasoom-gemedieerde afbraak. Hoe deze afbraak op moleculair niveau wordt gereguleerd, wat de biologische functies ervan zijn en hoe deze mechanismen zich evolutionair hebben ontwikkeld, zijn echter grotendeels onbeantwoorde vragen.

In dit proefschrift onderzoek ik de mechanismen, functies en de evolutionaire oorsprong van ARF-afbraak. Om deze vragen te beantwoorden maak ik gebruik van het levermos model Marchantia polymorpha. Marchantia bezit een minimaal, maar toch volledig, auxine signaleringsnetwerk en vormt daardoor een krachtig modelsysteem om fundamentele regulatoire mechanismen te bestuderen die in vaatplanten mogelijk verborgen blijven door genetische redundantie. Met een combinatie van genetische, biochemische en evolutionaire benaderingen toon ik in dit proefschrift aan dat afbraak van ARF transcriptiefactoren via het proteasoom een essentieel regulatiemechanisme vormt dat auxineresponsen vormgeeft.

In Hoofdstuk 1 introduceer ik auxine, haar rol in plantontwikkeling en het mechanisme van auxinesignalering. Dit hoofdstuk sluit af met een overzicht van de centrale thema’s en onderzoeksvragen die in de daaropvolgende hoofdstukken worden behandeld. Hoofdstuk 2 biedt een conceptueel en historisch kader voor het proefschrift. Hierin bespreek ik de ontdekking van auxine en de chronologische ontrafeling van het Nuclear Auxin Pathway-model, met bijzondere aandacht voor de rol van het ubiquitine-proteasoomsysteem binnen auxinesignalering. Daarnaast bespreekt dit hoofdstuk aanwijzingen dat ARF-proteïnen zelf mogelijk door afbraak worden gereguleerd en worden belangrijke openstaande vragen in het veld gedefinieerd en uiteengezet. In Hoofdstuk 3 ontwikkelen we experimentele hulpmiddelen om de dynamiek van auxinesignalering in vivo te bestuderen. Met behulp van homologe recombinatie worden fluorescent gelabelde knockin lijnen gegenereerd in Marchantia waarmee auxinesignaleringscomponenten vanuit hun endogene genomische loci kunnen worden gevisualiseerd. Deze experimenten leggen dynamische accumulatiepatronen van ARF-proteïnen bloot en laten zien dat proteasoom-gemedieerde afbraak de stoichiometrie van ARF-proteïnen tijdens de ontwikkeling snel kan veranderen. Deze observaties roepen nieuwe vragen op over de mechanismen die deze afbraak reguleren, die ik in de daaropvolgende hoofdstukken heb onderzocht. In Hoofdstuk 4 onderzoek ik de moleculaire basis van ARF-afbraak. Via analyses van eiwitsequenties identificeren we een geconserveerd motief in het DNA-bindingsdomein van ARF-proteïnen dat fungeert als een afbraaksignaal. Functionele experimenten tonen aan dat dit motief noodzakelijk is voor ARF-afbraak en laten zien dat vergelijkbare mechanismen aanwezig zijn in diverse plantensoorten. Daarnaast laten we zien dat verstoring van dit afbraaksignaal de afbraak van ARF-proteïnen belemmert, met ernstige gevolgen voor de ontwikkeling. In Hoofdstuk 5 onderzoek ik de ontwikkelingsbiologische gevolgen van verstoring van ARF-stabiliteit in meer detail. Door het genereren van induceerbare gestabiliseerde ARF-varianten, het complementeren van mutanten en een uitgebreide analyse van bijbehorende mutantfenotypes laat dit hoofdstuk zien dat gereguleerde ARF-afbraak essentieel is voor normale ontwikkeling en voor vrijwel alle levensstadia van Marchantia noodzakelijk is. Bovendien tonen de resultaten aan dat de A- en B-klasse ARF-proteïnen verschillen in hun afhankelijkheid van proteolytische regulatie. In Hoofdstuk 6 en Hoofdstuk 7 richt ik me op het identificeren van componenten die betrokken zijn bij ARF-afbraak, waarbij verschillende maar complementaire strategieën worden gebruikt. In Hoofdstuk 6 rapporteer ik een forward genetische screen in het mos Physcomitrium patens om regulators van ARF-afbraak te identificeren. Ik isoleer hier mutanten waarin de stabiliteit van ARF-proteïnen verhoogd is, en breng de causale mutaties in kaart. Vervolgens identificeren we de genetische componenten die hiervoor mogelijk verantwoordelijk zijn. De experimenten die hier weer op volgen suggereren echter dat onze kandidaten waarschijnlijk geen directe rol spelen binnen het proces van ARF-afbraak. Hoofdstuk 7 maakt gebruik van TurboID-gebaseerde “proximity labeling” om eiwitten te identificeren die geassocieerd zijn met instabiele ARF-eiwitten. Deze benadering leverde een reeks kandidaat-interactiepartners op die mogelijk deel uitmaken van ARF-afbraakcomplexen. Deze genen bleken echter moeilijk te muteren, waardoor functionele analyse momenteel niet mogelijk is. Daarom worden alternatieve strategieën voorgesteld om hun mogelijke rol in ARF-afbraak te testen. In Hoofdstuk 8 integreer ik de bevindingen van dit proefschrift, bespreekt hun biologische betekenis en plaatst ze in een bredere context van auxinebiologie, plantontwikkeling en evolutie. Daarnaast worden openstaande vragen uiteengezet en toekomstige onderzoekslijnen geschetst die gericht zijn op het identificeren van de moleculaire machinerie die verantwoordelijk is voor ARF-proteolyse.

Het werk dat ik in dit proefschrift presenteer laat zien dat afbraak van ARF-transcriptiefactoren via het proteasoom een centraal regulatiemechanisme omvat in auxinesignalering en plantontwikkeling, met diepe evolutionaire wortels.