Maria Magdalena Zorro Manrique

Coeliakie (CeD) is een auto-immuunziekte die veroorzaakt wordt door het eten van graanproducten die het eiwit gluten bevatten. Gluten komen veel voor in een Westers dieet. Bij iemand met coeliakie ontstaan door het eten van gluten ernstige ontstekingsreacties in de dunne darm. De enige effectieve behandeling voor coeliakie bestaat uit het levenslang volgen van een strikt glutenvrij dieet. Met name voor jonge patiënten is het moeilijk om zich aan een glutenvrij dieet te houden. Het volgen van een glutenvrij dieet is complex en de kans op een tekort aan voedingsstoffen is groot. Ook kan het een belemmering vormen in het sociale leven. Een bijkomend probleem is dat veel voedingsbronnen verborgen sporen van gluten bevatten. Om verdere behandeling en preventieve maatregelen te ontwikkelen, is er een beter begrip nodig van de precieze onderliggende mechanismes die deze ziekte veroorzaken.

CeD is een auto-immuunziekte die veroorzaakt wordt door deregulatie van een groot scala aan verschillende celtypes wat vervolgens leidt tot inflammatie en beschadiging van het darmslijmvlies in de dunne darm. Eén van de celtypes die hierbij betrokken zijn, zijn CD4+ T cellen, afkomstig uit het adaptieve immuunsysteem. Deze cellen produceren interferon gamma (IFNg), een cytokine dat een belangrijke rol speelt in het rekruteren en activeren van andere immuun cellen. Intra-epitheliale cytotoxische lymfocyten (IEL-CTLs) zijn daarnaast ook betrokken bij het inflammatieproces. Deze effector cellen zijn verantwoordelijk voor de beschadiging van de epitheelcellen die de darmwand vormen. Ook B-cellen spelen een rol in de pathobiologie van CeD. Deze cellen produceren auto-antilichamen en presenteren gluten peptiden aan de CD4+ T cellen. Daarnaast zijn cellen uit het aangeboren immuunsysteem betrokken, zoals macrofagen en dendritische cellen. Deze dragen bij aan de activatie en migratie van cellen uit zowel het adaptieve als het aangeboren immuunsysteem, hoofdzakelijk door de cytokines die ze produceren. Tenslotte is het mogelijk dat epitheelcellen, direct of indirect, bijdragen aan de ziekte. Bijvoorbeeld door het reguleren van het transport van ionen en nutriënten naar het lichaam en door de expressie van moleculen/cytokines die de differentiatie en functie van de immuun cellen beïnvloeden.

Met behulp van genoom brede associatiestudies (GWAS) zijn in het laatste decennium vele genetische varianten geïdentificeerd die een verhoogd risico op CeD geven. Onderzoek heeft uitgewezen dat deze varianten de expressie van bepaalde genen veranderen (ook wel kandidaat genen genoemd). Deze kandidaat genen zouden de functie van immuun- en darmepitheelcellen kunnen veranderen en op die manier kunnen bijdragen aan een verhoogd risico op CeD. Het doel van dit proefschrift was om meer inzicht te krijgen in de functie van enkele kandidaat genen én de biologische mechanismen waar deze genen bij betrokken zijn. Om dit te onderzoeken heb we in silico methodes geïntegreerd met experimenten in het laboratorium en gebruik gemaakt van cellen en omgevingsfactoren die waarschijnlijk relevant zijn voor CeD.

Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de voornaamste celtypes, cytokines, immuun moleculen en genetische- en omgevingsfactoren die zouden kunnen bijdragen aan CeD. Daarnaast brengen we de tekortkomingen in beeld in het nauwkeurig aanwijzen van kandidaat genen en beschrijven we enkele manieren om dit te ondervangen. Tenslotte is hier een overzicht van de verschillende hoofdstukken te vinden.

Hoewel de meeste kandidaat genen die geassocieerd zijn met CeD een rol spelen in het immuunsysteem, is het bekend dat niet immuun-gerelateerde genen, zoals LPP, ook bij kunnen dragen aan de ziekte. Eerdere in silico studies suggereren dat dit slecht gekarakteriseerde gen mogelijk betrokken is bij de barrièrefunctie van de darm, waarvan bekend is dat deze ontregeld is bij CeD patiënten. In hoofdstuk 2 bestuderen we de rol die LPP speelt in darmepitheelcellen. We hebben darmepitheelcellen ontwikkeld met een verminderde LPP-expressie (dit wordt LPP knockdown genoemd). Deze cellen vertoonden veranderingen in essentiële functies ten opzichte van darmepitheelcellen met een normaal LPP-expressieniveau (controles genaamd). Deze veranderingen hadden betrekking op celgroei, doorlaatbaarheid van de cellulaire barrière en het vermogen om georganiseerde structuren te vormen. Verrassend genoeg lieten de LPP knockdown cellen een verhoogde ontstekingsreactie zien na blootstelling aan IFNg, een cytokine waarvan we weten dat het de ontstekingsreactie in CeD versterkt. Deze resultaten suggereren dat LPP bijdraagt aan de ziekte via zowel non-immuun als immuun functies van darmepitheelcellen.

In hoofdstuk 3 hebben we 118 CeD-geassocieerde kandidaat genen geïdentificeerd door middel van expression quantitative trait loci (eQTL) analyse en vervolgens verschillende statistische benaderingen toegepast om eQTL genen aan een genetisch risico op CeD te koppelen. Vervolganalyses suggereren dat deze genen algemene en immuun-specifieke processen beïnvloeden in de verschillende celtypes die in de darm aanwezig zijn. Een interessante bevinding was dat een van de kandidaat genen, TRAFD1, een centrale regulator blijkt te zijn van 40 genen die nauw betrokken zijn bij IFNg signalering en het verwerken en presenteren van antigenen via Major Histocompatibility Class I (MHC I) moleculen. Van deze biologische mechanismen is bekend dat ze bijdragen aan abnormale activatie van immuun cellen, in het bijzonder de IE-CTLs. Deze cellen zijn verantwoordelijk voor het vernietigen van gezonde darmepitheelcellen, wat resulteert in beschadigingen aan het darmweefsel in CeD. Hoewel verdere experimentele validatie voor veel van de kandidaat genen nodig is, bieden de resultaten in dit proefschrift een startpunt dat verder kan leiden naar een verbeterd inzicht in de rol van genetische varianten in de immuunreactie die karakteristiek is voor CeD.

CeD ontstaat wanneer het immuun system haar tolerantie verliest voor de, normaal gesproken, onschadelijke gluten peptiden. Dit heeft een ontstekingsreactie gemedieerd door het adaptieve en aangeboren immuunsysteem tot gevolg. Eén van de factoren die bijdraagt aan het verliezen van deze tolerantie is een ontregeling in cytokineproductie. In hoofdstuk 4 hebben we onderzocht hoe cytokines, die verhoogd zijn in weefsels die door auto-immuunziektes zijn aangedaan (IFNb, Il-15 en IL-21), de genexpressie profiel van IE-CTLs veranderen. Dit celtype is verantwoordelijk voor de darm beschadiging in CeD. Ondanks dat ieder individueel cytokine de expressie van specifieke genen induceert in IE-CTLs, ontdekten wij dat al deze cytokines genen induceren die geassocieerd zijn met IFN en IFNg signalering. Beiden zijn essentieel voor immuun cel activatie en het voortzetten van inflammatie. Aangezien de cytokines, die we hebben gebruikt voor de experimenten ook aanwezig zijn in weefsels aangedaan door auto-immuunziekte, duidt dit resultaat erop dat IFN-signalering een algemeen mechanisme is dat leidt tot een afwijkende activatie van IE-CTLs, wanneer ze blootgesteld zijn aan abnormale inflammatoire omstandigheden. Deze aanname werd verder bevestigd door het bestuderen van genen, gelegen in regio’s van het DNA die geassocieerd zijn met meerdere auto-immuun ziektes, waarvan de expressie verhoogd of verlaagd is in IE-CTLs na blootstelling aan verschillende cytokines. Hier ontdekten wij dat de genen die aangedaan zijn na het stimuleren van IE-CTLs met verschillende cytokines, verrijkt zijn voor genen die gelegen zijn in regio’s die geassocieerd zijn met tien veel voorkomende auto-immuun ziektes. Het is interessant dat, voor de meeste van de onderzochte auto-immuun ziektes, de ziekte-geassocieerde genen die gevonden werden verrijkt zijn voor genen die betrokken zijn bij IFN-signalering. Zodoende toont dit resultaat het belang van IE-CTLs en IFN signalering niet alleen voor CeD aan, maar ook voor andere auto-immuun ziektes. Deze informatie zou van belang kunnen zijn voor het ontwikkelen van therapieën die kunnen helpen bij het verminderen van een abnormale ontstekingsreactie.

Door de komst van next generation sequencing technologieën zijn er verschillende niet-coderende RNA-moleculen ontdekt in ons DNA. Onder andere long non-coding RNAs (lncRNA) en microRNAs hebben veel aandacht gekregen dankzij hun rol in de regulatie van biologische mechanismen zoals genexpressie, immuun cel differentiatie en activatie (besproken in hoofdstuk 5). Ook heeft onderzoek uitgewezen dat er een mogelijke associatie bestaat tussen een verandering in de expressie van deze RNA-moleculen en verschillende vormen van kanker en auto-immuun ziektes. Ondanks de belangrijke rol van deze moleculen, blijft de precieze functie slecht begrepen.

In een poging om de rol van lncRNAs in het aangeboren immuunsysteem beter te begrijpen, hebben we lncRNAs (RP11-291B21.2) gekarakteriseerd in IEL-CTLs (hoofdstuk 6). We hebben het expressie patroon van RP11-291B21.2 bestudeerd in verschillende immuun cel populaties afkomstig uit bloed en ontdekten dat deze lncRNA uitsluitend tot expressie komt in CTLs. Ook zien we dat het expressie niveau van RP11-291B21.2 hoger is wanneer de CTLs minder actief zijn, wat suggereert dat deze lncRNA een rol zou kunnen spelen in T-cel activatie. Deze bevinding is verder bevestigd door het combineren van een co-expressie netwerk analyse (een in silico analyse om de functie van een gen te voorspellen) met experimenten in cellen met een verminderde expressie van RP11-291B21.2 (knockdown). We observeren een vermindering in de productie van cytokines die relevant zijn voor CeD (IFNg en TNF) en een verminderde expressie van verschillende genen die geassocieerd zijn met cel activatie en inflammatie wanneer we de RP11-291B21.2 knockdown vergelijken met de controles. Alhoewel we niet volledig begrijpen hoe RP11-291B21.2 de activatie van IE-CTLs beïnvloedt vormen onze resultaten een interessante basis voor verder onderzoek naar RP11-291B21.2 in CTL biologie en in auto-immuun-gemedieerde ziektes waarin een abnormale CTL activatie geassocieerd is met weefsel afbraak.

Tenslotte heb we in hoofdstuk 7 de belangrijkste bevindingen van dit proefschrift samengevat. Verder bespreek we enkele tekortkomingen in het vaststellen van kandidaat genen en biologische mechanismen geassocieerd met CeD. Daarnaast bespreek we hoe nieuwe technologieën kunnen worden gebruikt om deze tekortkomingen te overkomen en om hypotheses, die voortkomen uit in silico analyses of in vitro modellen, te ondersteunen, zodat deze bij kunnen dragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies voor CeD.