Marcel Van Willigen

Eiwitvouwing
Eiwitten spelen een fundamentele rol in alle processen in onze cellen, en dus ons leven. Ze zijn opgebouwd uit aminozuren die als de bouwstenen in ketens aan elkaar geregen zijn. Voordat een eiwit functioneel is, moet deze keten eerst vouwen om de juiste 3D-structuur aan te nemen. Bij dit vouwingsproces kan veel fout gaan en om het in goede banen te leiden, beschikt de cel over eiwitten die een kwaliteitscontrole uitvoeren. Als deze detecteren dat het fout gaat, worden de verkeerd gevouwen eiwitten afgebroken. Ondanks deze voorzorgsmaatregel kan er een kink in de kabel optreden indien de kwaliteitscontrole de verkeerd gevouwen eiwitten niet of te laat herkent en deze ophopen zoals bijvoorbeeld bij Parkinson of Alzheimer gebeurt. De fout kan ook genetisch zijn waardoor het aangemaakte eiwit altijd verkeerd vouwt en word afgebroken, wat ook weer kan leiden tot een ziektebeeld. De meest voorkomende genetische aandoening die leidt tot vouwingsfouten is Cystic Fibrosis (CF), in Nederland ook wel bekend als taaislijmziekte.

Cystic Fibrosis
CF komt voor bij ongeveer 1 op de 5.000 pasgeboren kinderen in Nederland. Deze dodelijke ziekte manifesteert zich vooral in de darmen en de longen waar de patiënten met CF een dik en taai slijm hebben waardoor het moeilijk is om voedingstoffen op te nemen of te ademen en bacteriën blijven zitten die infecties veroorzaken. De meeste patiënten overlijden aan terugkerende infecties die optreden in de longen en daar veel schade aanrichten. Tot voor kort was er geen medicijn dat de oorzaak van de ziekte directe aanpakte, en behandelingen waren vooral gericht op behandeling van de symptomen.
CF wordt voornamelijk veroorzaakt door een gebrek aan functioneel CFTR-eiwit (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), dat dient als kanaal voor negatief geladen ionen. Door het transport van ionen heen en weer over het celmembraan wordt er een vochtbalans in de longen onderhouden die de dikte en viscositeit van het slijm bepaalt. Genetische veranderingen (mutaties) in het DNA leiden tot afwijkingen in de aanmaak en functie van het CFTR-eiwit waardoor de vochtbalanscontrole wordt ontregeld, hetgeen de oorzaak is van het dikke en taaie slijm.
CFTR wordt aangemaakt in het endoplasmatisch reticulum (ER), net zoals alle membraan- en de meeste secretie-eiwitten. Na de aanmaak vindt in het ER ook de vouwing en kwaliteitscontrole plaats. Het CFTR-eiwit bestaat uit 5 delen, ook wel domeinen genoemd, die eerst onafhankelijk vouwen en daarna interacties met elkaar aangaan om zo een kanaal te vormen. Twee van deze domeinen zitten in het celmembraan (TMD1, TMD2) en de andere domeinen (NBD1, NBD2, en R) zitten in het cytosol. Dit samengaan van de domeinen, ook wel assemblage genoemd, moet goed verlopen om een functioneel eiwit te vormen. Bij een groot deel van patiënten met CF gaat er iets in het vouwings- en assemblage-proces mis waardoor het eiwit word afgebroken of niet functioneel is. Hoe vouwing en assemblage precies gebeuren en hoe genetische veranderingen deze processen beïnvloeden is nog vrijwel onbekend.

Proefschrift
In dit proefschrift bestuderen we de vouwing en assemblage van CFTR-domeinen (samen de vouwing van het CFTR-eiwit genoemd) en hoe mutaties dit proces beïnvloeden. CFTR-vouwing hebben we onderzocht door CFTR te labelen en daarna gecontroleerd in stukjes te knippen, waarbij een goed gevouwen eiwit in grotere stukjes word geknipt, omdat de schaar, het protease, niet bij bepaalde knip-plekken kan. Indien het eiwit niet goed vouwt zijn al deze knip-plekken beschikbaar en zal het verkeerd gevouwen CFTR in kleinere stukjes worden geknipt. Zo kunnen we onderscheid maken tussen zowel vroege (minder gevouwen, meer knipplekken) en late stadia (meer gevouwen, minder knipplekken) in vouwing en goed (meer gevouwen, minder knipplekken) en verkeerd gevouwen (minder gevouwen, meer knipplekken) CFTR. De opgedane kennis in dit proefschrift kan toegepast worden voor de ontwikkeling van medicatie en voor voorspellen welke medicatie werkt op welke patiënt. Ook lijkt CFTR op verschillende andere eiwitten in de cel en kunnen de nieuwe inzichten waarschijnlijk geëxtrapoleerd worden naar deze vergelijkbare eiwitten.

In Hoofdstuk 1, word het hele proces van eiwit-aanmaak, -vouwing, -transport en -afbraak uitgebreid beschreven in het algemeen. Daarna wordt uiteengezet wat er bekend is over eiwitten die lijken op CFTR, de zogenoemde ABC-transporter familie, en in meer details wat we al weten over CFTR-vouwing en -functie zelf.

In Hoofdstuk 2 hebben we een bepaalde groep van patiënt-mutaties onderzocht die wel in het celmembraan op de goede plek zitten maar daar nog niet functioneren. In dit hoofdstuk wordt beschreven hoe één van deze mutaties verkeerd geclassificeerd is en verkeerd vouwt en daardoor minder op het celmembraan voorkomt. In dit hoofdstuk wordt ook verklaard waarom deze uitzondering niet reageert op een medicijn dat helpt bij het verbeteren van CFTR-functie.

In Hoofdstuk 3 zijn de meest voorkomende patiëntmutanten bestudeerd op hun vouwing. In het vroege vouwingsproces hadden de meeste van deze mutaties weinig effect op de vouwing, behalve als ze in het NBD1 domein zaten. Anderzijds werden later tijdens de vouwing grote verschillen waargenomen tussen de verschillende mutanten. We vonden dat vooral mutaties in TMD1 of NBD1 grote gevolgen hadden voor de hoeveelheid CFTR die naar het celmembraan getransporteerd wordt. Ook zagen we dat in patiëntmutanten de hoeveelheid domein-assemblage een maat is voor transport naar het celoppervlak. In dit hoofdstuk stellen we twee manieren voor om de juiste behandeling te kunnen selecteren voor patiënten met zeldzame mutaties.

In Hoofdstuk 4 hebben we onderzocht of de klinische verschillen tussen patiënten met dezelfde genetische afwijkingen in het DNA van CFTR zich laten verklaren door onderscheid in het vouwingsproces. We vonden dezelfde mate van vouwing van het NBD1 domein bij verschillende patiënten en ook de hoeveelheid van het helper eiwit Hsp90 bleek identiek te zijn. In de discussie van dit hoofdstuk leggen we uit door welke andere oorzaken de ernst van de ziekte bij patiënten met dezelfde genetische afwijking in het CFTR kan worden veroorzaakt.

In Hoofdstuk 5 hebben we de eerste vroege vouwingsstadia van CFTR onderzocht. We vonden dat TMD1 eerst vouwt, waarbij het begin en het einde van het domein bij elkaar moeten komen. Daarna gaat het NBD1-domein, al voordat het compleet is aangemaakt, interacties aan met TMD1. Het medicijn VX-809 verbetert de vouwing en integratie van de uiteinden van TMD1. Het bijeenkomen van het begin en einde van TMD1 is een belangrijke stap voor CFTR om de kwaliteitscontrole te passeren en dus om naar het celmembraan te komen.

In Hoofdstuk 6 richten we ons op de latere stappen van CFTR-vouwing, voornamelijk wanneer de domeinen bij elkaar komen. We vonden dat NBD2 pas laat in het proces assembleert met TMD1 en TMD2. Deze interactie was niet belangrijk voor andere stappen in het vouwingsproces en om door de kwaliteitscontrole te komen, maar wel voor de functie van CFTR. In veel patiëntmutanten ontbreken deze interacties dan ook. We hebben in dit hoofdstuk ook gekeken naar de medicijnen die helpen de functie van CFTR te verbeteren (VX-770 en GLPG1837), waarbij we zagen dat beide geneesmiddelen een vergelijkbaar werkingsmechanisme hadden.

In Hoofdstuk 7 hebben we uitgezocht wat de vereisten zijn voor de domeinen van CFTR om bij elkaar te komen en wanneer CFTR door de kwaliteitscontrole komt om naar het celoppervlak getransporteerd te worden. Hier laten we zien dat de link tussen TMD1 en TMD2 met NBD1 belangrijk is om op het celoppervlak te komen. Anderzijds is de connectie van TMD2 met NBD1 en TMD1 met NBD2 vooral belangrijk voor domeinassemblage. Hoewel TMD1 en TMD2 samen al kunnen assembleren zijn NBD1 en NBD2 nodig om deze interactie te stabiliseren. Ook beschrijven we de rol van het beginstukje van TMD1 in domeinassemblage en transport van CFTR.

Conclusies en implicaties
In Hoofdstuk 8 hebben we uitgebreid beschreven hoe het werk van dit proefschrift gaten vult in bestaande kennis en hoe delen van het proefschrift verder bouwen op deze kennis. Samenvattend vonden we dat patiëntmutaties vooral effect hebben op late stadia in de vouwing. Hierbij spelen vooral de TMD1- en NBD1-domeinen een belangrijke rol, hetgeen suggereert dat vouwing en assemblage van CFTR-domeinen in volgorde van aanmaak gebeurt. Deze resultaten zijn belangrijk voor geneesmiddelontwikkeling of om te voorspellen welke behandeling werkt voor welke patiënt. Bovendien lijken onze resultaten een bredere toepassing te kunnen hebben bij het ontrafelen van de vouwing van eivitten die qua structuur lijken op CFTR. Vouwingsafwijkingen in deze eiwitten veroorzaken vaak een ziektebeeld bij hyperactiviteit van cellen (bijv. kanker) of juist bij slecht functioneren van cellen (bijv. ziekte van Stargardt).