Linda van den Berk

Het optreden van ernstige bijwerkingen is een van de belangrijkste oorzaken dat een medicijn de markt niet bereikt of na het goedkeuren wordt teruggetrokken. De lever, de nieren, en het hart worden vaak getroffen door bijwerkingen en de schade die hierbij ontstaat is in veel gevallen onomkeerbaar. De meeste bijwerkingen ontstaan door gebruik van een medicijn in een te hoge dosis en zijn daardoor redelijk voorspelbaar. Bij een zeer klein deel van de patiënten ontstaat de toxiciteit echter ook bij normaal gebruik; dit wordt idiosyncratische toxiciteit genoemd. Er zijn meerdere oorzaken van idiosyncratische toxiciteit, waaronder interacties tussen het medicijn en patiënt-afhankelijke factoren, zoals genetische opmaak van een individu, de aanwezigheid van onderliggende ziekten en ontstekingsreacties. Medicijnen die ernstige idiosyncratische toxiciteit veroorzaken worden minder vaak voorgeschreven en krijgen een extra zware waarschuwing in de bijsluiter. Het is belangrijk om onderzoek te doen naar de mechanismes die leiden tot deze bijwerkingen, om zo in een vroeg stadium te kunnen voorspellen of een patiënt gevoelig is voor deze toxiciteit met als doel om uiteindelijke orgaanschade te voorkomen. De meeste medicijnen activeren bepaalde processen, zogenaamde adaptieve stress responsen, om organen te beschermen tegen schade. Als de schade binnen de perken blijft, dan kan een cel hiervan herstellen. Echter, wanneer de schade een drempelwaarde heeft bereikt, dan zal deze overschakelen op specifieke celdood programma’s. Zowel stress, celdood, als een onderliggende infectie kunnen zorgen dat een bepaald type immuun cellen, genaamd macrofagen, het ontstekingsbevorderende eiwit TNF-α gaan produceren. In een gezonde of minimaal gestreste cel kan TNF-α overleving bevorderen via de activatie van de transcriptie factor NF-κB. In het geval van een door medicijngebruik zeer gestreste cel, kan de aanwezigheid van TNF-α deze balans verstoren en leiden tot celdood. Om vroeg in de ontwikkeling van een medicijn vast te stellen of een geneesmiddel bepaalde stress veroorzaakt, zijn preklinische experimenten nodig. Er zijn verschillende soorten preklinische weefselkweek modellen beschikbaar om geneesmiddelen op te testen. Echter voor het specifiek bestuderen van TNF-α geïnduceerde stress, is een preklinisch model nodig dat goed reageert op dit ontstekingseiwit om met een zo’n groot mogelijke kans dit type bijwerking op te pikken in het laboratorium. Een relatief nieuwe categorie modellen voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, ziekte en toxiciteit is gecentreerd rond het gebruik van pluripotente stamcellen. Deze stamcellen zijn geherprogrammeerd vanuit een somatische cel bijvoorbeeld uit de huid, urine of het bloed en hebben de capaciteit om vervolgens te differentiëren in elke cel van het lichaam. Door de embryonale ontwikkeling buiten het lichaam na te bootsen kunnen bijvoorbeeld hepatocyten (lever), cardiomyocyten (hart) en de proximale tubulus (nier) gemaakt worden en vervolgens kunnen deze cellen blootgesteld worden aan geneesmiddelen om de medicijnveiligheid te bestuderen. In dit proefschrift hebben we verschillende preklinische modellen vergeleken en gebruikt voor het meten van (TNF-α geïnduceerde) stress om zo te bepalen welk model het meest bruikbaar is voor ons in het lab. In hoofdstuk 2 hebben we gekeken of een bestaand model dat gebruikt maakt van HepG2 lever carcinoomcellen relevanter gemaakt kan worden. Onder 2D kweekomstandigheden hebben deze kankercellen een lage expressie van eiwitten die essentieel zijn voor het omzetten van geneesmiddelen. Door HepG2 cellen in 3D te kweken in Matrigel wordt de expressie van dit soort eiwitten belangrijk voor metabolisme van een medicijn verhoogd. Matrigel is echter afkomstig uit muizentumoren en is er erg veel variabiliteit tussen verschillende Matrigel batches, waardoor de reproduceerbaarheid niet gegarandeerd kan worden. Door Matrigel te vervangen door een zelf gesynthetiseerde gel met arginylglycylaspartic acid (RGD) peptiden konden we 3D sferoïden genereren met een beter metabolisme dan de sferoïden die in Matrigel werden gemaakt, gebaseerd op de expressie van verschillende enzymen, medicijntransporters en andere essentiële markers die van belang zijn in de lever. Het lijkt erop dat deze nieuwe gel een goed alternatief is om HepG2 sferoïden te maken, maar de toekomst zal moeten blijken of dit nieuwe model ook beter is in het voorspellen van toxiciteit na blootstelling aan geneesmiddelen. Voor het voorspellen van immuun-gemedieerde toxiciteit is een levermodel nodig dat goed reageert op pro-inflammatoire eiwitten. Daarom hebben we in hoofdstuk 3 beoordeeld hoe vijf verschillende lever modellen reageren op verschillende immuun-gerelateerde cytokines, zoals TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, en IL-18. De verschillende levermodellen bestonden uit primaire humane hepatocyten, die als de goudstandaard worden gezien binnen het onderzoek naar bijwerkingen van geneesmiddelen in de lever. Daarnaast hebben we HepG2 kankercellen gekweekt in 2 verschillende celkweek media en hebben we pluripotente stamcellen gedifferentieerd naar hepatocyten. Het laatste model bestond uit sferoïden bestaande uit meerdere celtypen (hepatocyten, stellaat cellen en Kupffer cellen) die aanwezig zijn in de lever om zo nog beter de lever na te bootsten. Op basis van TempO-seq analyse, een gerichte RNA sequencing techniek, hadden de meeste cytokines, inclusief IL-6, IL-10, IL-12 en IL-18, een minimaal effect op al deze levermodellen. Het pro-inflammatoire cytokine IL-1β zorgde voor een respons in alle vijf de levermodellen, maar we konden geen verschil opmerken in de mate van reactie. Wanneer we echter het effect van TNF-α bestudeerden, konden we verschillen opmerken in de mate waarop een lever model reageert. Primaire humane hepatocyten reageerden veel minder sterk op TNF-α vergeleken met de andere modellen en daardoor konden we concluderen dat deze primaire hepatocyten niet het meest geschikte model zijn om de interactie van een medicijn en TNF-α te onderzoeken. Hepatocyten gemaakt van pluripotente stamcellen lieten daarentegen een soortgelijke, maar vele malen sterkere respons zien op TNF-α vergeleken met primaire hepatocyten. Daarom hebben we vervolgens in het stamcelmodel verder onderzocht of niet-steroïde anti-inflammatoire middelen (NSAIDs) en TNF-α met elkaar interacteren en de immuun-gerelateerde stress induceren. Uiteindelijk konden we concluderen dat deze interactie en bijkomende celdood was zoals verwacht met verschillende NSAIDs waarvan al bekend was dat ze immuun-geïnduceerde levertoxiciteit veroorzaken. Aangezien we in hoofdstuk 3 hebben laten zien dat hepatocyten gemaakt van pluripotente stamcellen goed reageren op immunomodulatoren, besloten we dat dit het beste model was om de interactie van een geneesmiddel en TNF-α verder te onderzoeken op grotere groepen medicijnen. Dit is doorgaans een duur en tijdrovend proces. Idealiter zou de mogelijke toxiciteit van deze kandidaat geneesmiddelen snel en goedkoop bepaald moeten kunnen worden aan de hand van de activatie van stress responses eiwitten, zoals het geval is bij bijvoorbeeld inflammatie. Om te bepalen of er inflammatie optreedt kunnen we pluripotente stamcellen gebruiken waar bepaalde eiwitten gekoppeld zijn aan een fluorescent eiwit, deze vervolgens differentiëren naar hepatocyten en vervolgens blootstellen aan een kandidaat geneesmiddel en TNF-α. Onder de confocale microscoop kleuren deze cellen vervolgens groen op en kunnen we bepalen of er inflammatie is opgetreden. In hoofdstuk 4 van dit proefschrift beschrijven we een methode om op een systematische manier genen te identificeren die geïnduceerd worden tijdens inflammatie in de lever. A20, LCN2, RND1, IRF1, VCAM1 en ICAM1 werden uiteindelijk geselecteerd als specifieke inflammatoire biomarkers en het fluorescente eiwit eGFP werd gekoppeld aan deze eiwitten om de cel te doen laten oplichten wanneer er inflammatie optreedt. Voor A20, IRF1, VCAM1 en ICAM1 hebben we op een succesvolle manier laten zien dat deze manier van het koppelen van een fluorescent eiwit aan een biomarker werkt in pluripotente stamcellen. Daarnaast kleurden deze cellen ook op wanneer ze werden gedifferentieerd naar hepatocyten. Ten slotte beschreven we dat deze biomarkers niet alleen inflammatie in de lever ontrafelen, maar dat deze fluorescerende pluripotente stamcellen ook gedifferentieerd konden worden naar cardiomyocyten om de activatie van inflammatoire verdedigingsmechanismen aan te tonen. De bruikbaarheid van deze fluorescerende stamcellen hebben we verder aangetoond in hoofdstuk 5. Hier hebben we stamcellen waar het inflammatoire eiwit ICAM1 is gekoppeld aan eGFP gedifferentieerd naar hepatocyten, cardiomyocyten en de proximale tubulus cellen van de nier. Vervolgens hebben we deze cellen behandeld met een relatief nieuwe groep kandidaat geneesmiddelen genaamd kinase remmers (760 kandidaten) en TNF-α. We hebben als een van de eersten laten zien dat het screenen van zo’n grote set medicijnen mogelijk is met stamcel model. Deze screen heeft aangetoond dat er veel overlap zit tussen geneesmiddelen die de expressie van ICAM1 blokkeren in de verschillende celtypen. Echter, wanneer we kijken naar kandidaten die de expressie van ICAM1, en dus inflammatie, verhogen, dan zien we bijna geen gelijkenis tussen deze kandidaat geneesmiddelen en de verschillende celtypen. Vervolgens hebben we ons verder verdiept in kandidaten die de expressie van ICAM1 verhogen in de proximale tubulus van de nier, aangezien dit wordt geassocieerd met het aantrekken en activeren van immuun cellen die verdere schade aan cellen en organen kunnen veroorzaken. We hebben gevalideerd dat kinase remmers die in klinische trials ook voor verhoogde inflammatie in de nier zorgen, ook geïdentificeerd konden worden in onze screen. Daarnaast hebben we op moleculair niveau laten zien dat dit mogelijk komt door de verhoogde uitscheiding van bepaalde pro-inflammatoire chemokines die verantwoordelijk zijn voor het aantrekken van immuun cellen die op deze manier verdere inflammatie en mogelijke schade stimuleren. Ten slotte beschrijven we dat deze kinase remmers vaak niet specifiek een kinase eiwit remmen, maar dat ze vaak off-target effecten hebben en daardoor mogelijk voor meer bijwerkingen zorgen. Dit benadrukt het belang om in vroege stadia van geneesmiddelontwikkeling al te kunnen voorspellen of een kandidaat wel of niet voor bijwerkingen zorgt. In dit proefschrift hebben we beschreven hoe we het meest relevante preklinische model om immuun-gerelateerde toxiciteiten in de lever, nieren en het hart kunnen identificeren. Het gebruik van fluorescente reporters voor inflammatie in pluripotente stamcellen en de gedifferentieerde celtypen hiervan dragen hieraan bij. Daarnaast kunnen we met deze preklinische experimenten grote groepen nieuwe geneesmiddelen op een relatief eenvoudige manier testen. Aan de hand van deze uitkomsten kunnen andere vervolg testen worden gedaan die bijdragen aan een breder inzicht van de moleculaire mechanismen achter deze toxiciteiten. Dit draagt bij aan het goedkoop en sneller detecteren van mogelijke bijwerkingen in vroege fases van medicijnontwikkeling en op deze manier zullen nieuwe geneesmiddelen hopelijk in de toekomst sneller op de markt verschijnen.