Fengjiao Bu

Stikstofbindende wortelknobbel-symbiose komt voor in tien taxonomische lijnen uit vier verwante ordes - Fagales, Fabales, Rosales en Cucurbitales - die samen de stikstofbindende clade (NFC) worden genoemd. Knobbelvormende planten binnen de NFC zijn verspreid over niet-knobbelvormende soorten en kunnen interageren met rhizobia of Frankia-bacteriën. Om een dergelijke endosymbiose tot stand te brengen, zijn twee processen essentieel: knobbel-organogenese en intracellulaire bacteriële infectie. Ondanks een aanzienlijke hoeveelheid kennis over de leguminoos-rhizobium symbiose, blijft het onduidelijk welke signaleringsmodules worden gedeeld tussen knobbelvormende soorten in verschillende taxonomische clades. Bovendien wordt algemeen aangenomen dat knobbelvorming meerdere keren onafhankelijk is geëvolueerd, hoewel moleculair-genetische ondersteuning voor deze hypothese ontbreekt.

Om deze vragen te beantwoorden is een vergelijkende genomische en transcriptomische analyse uitgevoerd met Parasponia-soorten (Cannabaceae), de enige niet-leguminosen die stikstofbindende knobbels kunnen vormen met rhizobium. Vergelijkend transcriptoomonderzoek van P. andersonii en de vlinderbloemige Medicago truncatula onthulde het gebruik van ten minste 290 orthologe symbiose-genen in knobbels. Hieronder bevinden zich sleutelgenen die bij leguminosen essentieel zijn voor knobbelvorming, waaronder NODULE INCEPTION (NIN) en RHIZOBIUM-DIRECTED POLAR GROWTH (RPG). Vergelijkende analyse van genomen van drie Parasponia-soorten en verwante niet-knobbelvormende plantensoorten laat bewijs zien van parallel verlies in niet-knobbelvormende soorten van vermeende orthologen van NIN, RPG en NOD FACTOR PERCEPTION. Parallel verlies van deze symbiose-genen wijst erop dat deze niet-knobbelvormende lijnen het potentieel om knobbels te vormen hebben verloren. Door gebruik te maken van het zeer efficiënte Parasponia-transformatieplatform hebben we promoter:GUS-expressieanalyse en CRISPR-Cas9-mutagenese uitgevoerd. In overeenstemming met leguminosen komen P. andersonii PanNIN en PanNF-YA1 samen tot expressie in knobbels. Door analyse van enkelvoudige, dubbele en hogere-orde CRISPR-Cas9 knockout-mutanten laten we zien dat knobbel-organogenese en vroege symbiotische expressie van PanNF-YA1 PanNIN-afhankelijk zijn en dat PanNF-YA1 specifiek vereist is voor intracellulaire rhizobium-infectie. Dit toont aan dat NIN en NF-YA1 geconserveerde symbiotische functies vervullen in niet-leguminose plantensoorten. Aangezien Rosales, Fabales en Fagales kort na het ontstaan van de knobbelvormingseigenschap uiteen zijn gegaan, stellen wij dat NIN en NF-YA1 de kern vormen van de transcriptionele regulatoren in deze symbiose. Alles bij elkaar genomen dagen deze resultaten de visie uit dat knobbelvorming parallel is geëvolueerd en roepen ze de mogelijkheid op dat knobbelvorming ~100 miljoen jaar geleden is ontstaan in een gemeenschappelijke voorouder van alle knobbelvormende plantensoorten, maar vervolgens verloren is gegaan in veel afstammelingen. Dit heeft verstrekkende gevolgen voor translationele benaderingen die gericht zijn op het ontwikkelen van stikstofbindende knobbels in gewassen.

De F1-hybride tussen de diploïde Parasponia andersonii en tetraploïde Trema tomentosa kan knobbels vormen, maar mist intracellulaire infectie bij inoculatie met Mesorhizobium plurifarium BOR2 of Bradyrhizobium elkanii WUR3. Op basis van de genetische samenstelling en het symbiotische fenotype stellen wij dat de F1-hybride mogelijk toekomstige engineering-resultaten nabootst. Daarom wilden we een beter inzicht krijgen in de afwijking in het knobbelvormingsfenotype van wildtype P. andersonii en F1-hybride planten. Hiervoor vergeleken we knobbelvormingsefficiënties en intracellulaire infectie in knobbelcellen na inoculatie met een reeks rhizobiumstammen, aangezien Parasponia kan interageren met een breed scala aan rhizobia. Dit onthulde dat het waardplantbereik van hybride planten nauwer is vergeleken met P. andersonii. We laten ook zien dat de blokkade in intracellulaire infectie in hybride knobbels consistent is voor alle geïdentificeerde knobbelvormende stammen en niet kan worden overwonnen door verhoogde LCO-biosynthese of door mutatie van de type III- of IV-secretiesystemen van de knobbelvormende stammen. De hybride planten kunnen effectief arbusculaire mycorrhizatie tot stand brengen, wat suggereert dat de blokkade van intracellulaire infectie rhizobium-specifiek is. Alles bij elkaar wijst dit op het optreden van een nog onbekend mechanisme dat leidt tot een aangetast waardplantbereik en blokkade van intracellulaire infectie van hybride planten. We merkten op dat knobbelvorming en intracellulaire infectie in P. andersonii correleert met de aanwezigheid van N-methylering door het bacteriële nodS-gen, dat codeert voor een N-methyltransferase die het niet-reducerende terminale residu van LCO's methyleert. Het belang van nodS wordt aangetoond door te laten zien dat LCO-signalering geïnduceerd door Rhizobium tropici CIAT899 verdwijnt wanneer nodS gemuteerd is. We concluderen dat de N-methyl-decoratie van het niet-reducerende terminale residu van LCO's essentieel is voor het tot stand brengen van een succesvolle stikstofbindende wortelknobbel-symbiose tussen rhizobium en Parasponia andersonii.