Ana Claudia Pacheco Correia

DEEL 1 - BIOMARKERS VOOR DE OPSPORING VAN EEN BARRETT SLOKDARM

In dit deel van het proefschrift richten we ons op de bepaling van nieuwe potentiële biomarkers voor de screening van personen met een Barrett slokdarm (BE) in de algemene bevolking. In hoofdstuk 1 laten we zien dat slokdarmkanker tot op heden nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken in de algemene bevolking is.

Slokdarmkanker staat wereldwijd momenteel op de 8ste plaats wat incidentie betreft, en op de 6de plaats wat algemene mortaliteit betreft, waarbij het adenocarcinoom (EAC) ongeveer twee derde van alle gevallen van slokdarmkanker vertegenwoordigt.

EAC-gevallen worden standaard gediagnosticeerd op basis van endoscopisch onderzoek, biopsie van slokdarmweefsel en het vinden van intestinale metaplasie bij histologisch onderzoek. BE is de belangrijkste risicofactor voor EAC, en wordt gewoonlijk alleen gediagnosticeerd tijdens endoscopisch onderzoek in geval van bijvoorbeeld reflux-symptomen (“zuurbranden”). Echter slechts een klein percentage van de BE-patiënten heeft reflux-symptomen en loopt dus toch risico op EAC. Tot op heden is het nog onduidelijk wat de prevalentie van BE is in de algemene bevolking. Een bevolkingsbrede screening zou nodig zijn om deze prevalentie vast te stellen, maar het gebruik van endoscopie-gebaseerde technologie is niet kosteneffectief gezien de hoge kosten en het invasieve karakter. De ontwikkeling van meer betaalbare en minder invasieve screening instrumenten, bijvoorbeeld biomarkers uit gemakkelijk te verkrijgen monsters, is nodig voor bevolkingsbrede screening, surveillance en diagnostische triage.

Als mogelijke strategie om te gebruiken als screeningsinstrument hebben we daarom in bloedmonsters van BE patiënten en van leeftijd- en geslacht-gematchte controles de concentraties van biomarkers BMP2, BMP4, en BMP5 onderzocht. Het resultaat daarvan is in Hoofdstuk 2 beschreven. Alle drie geteste BMPs bleken verhoogd te zijn in de groep BE patiënten in vergelijking met de controlegroep. BMP2 en BMP5 waren significant verschillend. Bovendien bleef, na multivariate analyse, BMP5 geassocieerd met een verhoogd risico op BE, onafhankelijk van andere risicofactoren, zoals roken, alcoholgebruik, obesitas, en de lengte van het Barrett segment. BMP5 lijkt daarmee een onafhankelijke risicofactor te zijn voor BE. Gezien de beperking van biomarkers in het bloed die momenteel worden onderzocht voor het opsporen van BE, is BMP5 een goede aanvulling als biomarker kandidaat.

DEEL 2 – KARAKTERISERING VAN ANTI-BMP4 EN ANTI-BMP2/4 LAMA-AFGELEIDE ANTILICHAMEN EN MOLECULAIRE STRATEGIE OM BARRETTS SLOKDARM TE MINIMALISEREN

In het tweede deel van dit proefschrift beschrijven we de resultaten van ons onderzoek naar de mogelijkheden van anti-BMP4 en anti-BMP2 lama-afgeleide antilichamen met betrekking tot specificiteit, effectiviteit en hun functionele potentieel in verschillende preklinische muismodellen. De karakterisering van deze lama-afgeleide antilichamen werd in eerder onderzoek gedaan door Calpe, S. et al. Zij lieten in verschillende in vitro modellen, de kleine en gunstige structurele eigenschappen van deze nanobodies, specifieke remming en een laag off-target effect, zien; zowel in verschillende cellijnen als in functionele organoïde cultuur.

In Hoofdstuk 3 gaan we verder met het karakteriseren van deze nanobodies door hun specificiteit en neutraliserend vermogen te bepalen in vergelijking met de huidige commercieel verkrijgbare BMP remmers. Anti-BMP4 en anti-BMP2/4 lama-afgeleide antilichamen werden vergeleken met 3 verschillende typen BMP remmers: natuurlijke antagonisten (Noggin en Gremlin), kleine-moleculen BMPR remmers (LDN-193189 en DMHN) en conventionele anti-BMP4 monoklonale antilichamen. Onze lama-afgeleide antilichamen bleken even specifiek te zijn als de anti-BMP4 monoklonale antilichamen, maar het neutralisatie vermogen van deze commerciële antilichamen was inferieur in vergelijking met onze nieuwe nanobodies. Epitope analyse suggereert dat de monoklonale antilichamen niet gericht zijn op de BMPR bindingsplaats, wat resulteert in hun geringere effectiviteit. Zowel natuurlijke antagonisten als klein-moleculen BMPR remmers hebben een lagere specificiteit, omdat ze niet alleen het signaal van BMP4 of BMP2/4 kunnen remmen, maar ook dat van andere BMPs met verschillende remming niveaus.

Vanwege de remmende en specificiteit eigenschappen van onze anti-BMP4 en anti-BMP2/4 lama-afgeleide antilichamen, hebben we hun functionele mogelijkheden verder onderzocht in verschillende in vivo muismodellen. Om te beginnen beschrijven we in Hoofdstuk 4 een nieuw in vivo cryoablatie muismodel. In dit translationele muismodel hebben wij een studie verricht naar de regeneratie van het neo-epitheel na cryoablatie van de squameus-columnaire junctie in de muizenmaag. Dit model kan worden gebruikt voor het testen van nieuwe farmacologische therapieën voor de behandeling van neo-epitheliale laesies, zoals BE. In dit diermodel tonen we aan dat remmen van de BMP signalering, door muizen na cryoablatie te behandelen met mNoggin (een natuurlijke inhibitor voor alle BMPs), het cilindrisch epitheel werd vervangen door neo-squameus epitheel.

In Hoofdstuk 5 beschrijven we hoe we dit muismodel verder hebben gebruikt om onze zeer selectieve BMP2 en BMP4 lama-afgeleide remmers te testen. Ten eerste bevestigden we dat de BMP2 en BMP4 signaalwegen sterk geactiveerd zijn in BE weefsel, terwijl BMP7 en TGF-β sterk geactiveerd zijn in normaal plaveiselepitheel weefsel. Ten tweede werden de functionele eigenschappen van anti-BMP2 en BMP4 lama-afgeleide antilichamen getest in een drietal modellen: een organoïd model, een transgene Barrett slokdarm model, en op het cryoablatie model, zoals beschreven in Hoofdstuk 4. Vervolgens hebben we onderzocht of het nieuwe (neo) plaveisel epitheel die we in de modellen zagen werkelijk uit plaveisel stamcellen afkomstig waren door dit proces ook te bestuderen in een zogenaamde lineage tracing muizenmodel, waarin Keratine 5 positieve (K5) plaveisel cellen in hun ontwikkeling kunnen worden gevolgd. In het in vivo organoïd model voor BE, remden we met succes de ontwikkeling van cilindervormige BE cellen, en bevorderden we de proliferatie van de normale slokdarm plaveiselcellen. In het transgene zogenaamde induceerbare Noggin knockdown muismodel, waarin BE-achtig neo-cilindervormig epitheel ontstaat vanuit de meerlagige klierbuizen, werd door remming van BMP2 en BMP4 door de anti-BMP2/4 lama-afgeleide antilichamen, ontwikkeling tot neo-squameus epitheel bevorderd. Verder zagen we in het cryoablatie muismodel, dat remming van BMP2 en BMP4, na cryoablatie van de overgangszone van het squameus- naar cilinder epitheel in de muis maag, tot regeneratie van het neo-squameus epitheel in plaats van neo-cilindrisch epitheel leidde. Tenslotte hebben we waargenomen dat de regeneratie van het neo-squameus epitheel in het cryoablatie muismodel, afkomstig bleek te zijn van de K5+ plaveisel stamcellen.

Al met al kunnen we concluderen dat vanwege de zeer specifieke remming van BMP2 en BMP4, we erin zijn geslaagd om de regeneratie en proliferatie van het plaveisel te bevorderen. Anti-BMP2/4 lama-afgeleide antilichamen bleken in vivo zeer specifieke en selectieve remmers te zijn, zonder bijwerkingen. De hier beschreven in vivo-modellen hielpen BMP2 en BMP4 te benadrukken als cruciaal moleculair therapeutisch doelwit voor de behandeling van BE.