Dora Angyal

Dit proefschrift beschrijft onderzoek naar de rol van bicarbonaattransport gemedieerd door het CFTR-kanaal in het ontstaan van alvleesklierontsteking en de verbetering daarvan door CFTR-modulatoren. Het eerste deel van dit werk concentreert zich op CFTR-gemedieerd aniontransport bij personen die een CFTR gen-variant dragen. Het tweede deel richt zich op de ontwikkeling van modellen voor het bestuderen van CFTR-functie in de alvleesklier.

In hoofdstuk 2 heb ik de huidige kennis over CFTR-afhankelijk bicarbonaattransport in alvleesklierbuis cellen uiteengezet, evenals de rol van dit transport in het ontstaan van taaislijmziekte (ook wel cystische fibrose (CF) genoemd), en van CFTR-gerelateerde en verworven vormen van alvleesklierontsteking.

De productie van alkalisch alvleesklier sap is sterk afhankelijk van CFTR. CFTR wordt geactiveerd na een maaltijd na stimulatie van cellen in de alvleesklierbuis door secretine. Dit hormoon induceert de productie van cyclisch AMP (cAMP) en kinase-gemedieerde fosforylering en activatie van CFTR. Door de gecoördineerd ion transport, gemedieerd door onder andere CFTR, kan de bicarbonaatconcentratie in humaan alvleesklier sap oplopen tot 140 mmol/L. Deze base-equivalenten neutraliseren het maagzuur dat de twaalfvingerige darm binnenkomt en ondersteunen de vertering van voedingsstoffen.

Gezien de belangrijke rol van CFTR in de productie van alkalisch alvleesklier sap, is het niet verrassend dat verlies van CFTR-functie, zoals bij CF, leidt tot ernstige aantasting van de exocriene alvleesklier functie. Net als bij andere erfelijke vormen van alvleesklierontsteking, lijken omgevingsfactoren in dit scenario weinig invloed te hebben op het ziekteverloop. Daarentegen wordt bij dragers van CFTR-varianten, die restfunctie van het kanaal behouden en geen CF veroorzaken, steeds duidelijker hoe belangrijk omgevingsfactoren zijn in het bepalen van de vatbaarheid voor ziekte. In deze groep wordt alvleesklierontsteking vaak uitgelokt door een externe prikkel, zoals de inname van een vetrijke maaltijd of alcohol. De hoge incidentie van CFTR-mutaties in de populatie met alvleesklierontsteking populatie wijst erop dat de exocriene alvleesklier zeer kwetsbaar is voor zelfs kleine verstoringen in de alvleesklier buis CFTR-activiteit. Aanvankelijk stille mutaties veroorzaken mogelijk geen duidelijke CF-achtige pathologie, maar kunnen de alvleesklier wel gevoeliger maken voor een tweede schadelijke prikkel. Dergelijke CFTR-allelen hebben mogelijk slechts een klein effect op het individuele risico, maar kunnen op populatieniveau het risico op alvleesklierontsteking aanzienlijk verhogen.

Deel I Alvleesklierontsteking bij dragers van CFTR-varianten
Geen van de bioassays die momenteel voor diagnostische doeleinden worden gebruikt, kan CFTR-gemedieerd bicarbonaattransport nauwkeurig beoordelen. Daarom hebben wij, vanwege de bijzondere relevantie van CFTR-afhankelijk bicarbonaattransport in de alvleesklier en omdat CFTR-mutaties de bicarbonaatdoorlaatbaarheid van CFTR kunnen verminderen, voor het werk in dit proefschrift assays gebruikt die specifiek ontworpen zijn om CFTR-gemedieerd bicarbonaattransport in patiëntweefsels te meten. In hoofdstukken 3–5 gebruikten we deze assays om een reeks (voornamelijk) zeldzame CFTR-mutaties te screenen en testten we tevens het effect van modulatoren op CFTR-gemedieerd bicarbonaat- versus chloridetransport.

Onder de verschillende onderzochte CFTR-varianten bevonden zich vier dragers van het D1152H-allel, een van de vermeende CFTR-BD-varianten (hoofdstuk 4). Deze vier personen droegen deze variant in trans met een minimale-functie-allel, oftewel een klasse I-mutatie. Hoewel de niveaus van resterend CFTR-gemedieerd chloride- en bicarbonaattransport tussen deze personen met een vergelijkbaar CFTR-genotype varieerden, zagen we in alle D1152H-lijnen een verlaagd chloridetransport ten opzichte van wildtype-controles. Bovendien verbeterde behandeling met modulatoren in alle gevallen niet alleen het bicarbonaattransport, maar ook duidelijk de chloride transportfunctie. Gezamenlijk pleiten deze bevindingen tegen de veronderstelling dat de D1152H-mutatie een specifiek defect veroorzaakt in de bicarbonaatpermeabiliteit van CFTR. Sterker nog, geen van de varianten onderzocht in hoofdstukken 3–5 vertoonde een specifiek defect in bicarbonaattransport, waardoor wij het bestaan daarvan niet konden bevestigen.

Onze studies omvatten ook een analyse van CFTR-activiteit in een cohort van patiënten met alvleesklierontsteking met CFTR-mutaties (hoofdstuk 5). Hieruit bleek dat CFTR disfunctie relatief frequent voorkomt bij patiënten met alvleesklierontsteking met CFTR-varianten, maar dat geen specifiek defect in CFTR-gemedieerd bicarbonaattransport werd aangetoond. Belangrijk is dat sommige personen in dit cohort met verlaagde CFTR-activiteit een wildtype CFTR-allel droegen, wat suggereert dat ziekte veroorzakende mutaties ook buiten de CFTR-locus kunnen liggen. De studie liet zien dat patiënt-afgeleide organoïden gebruikt kunnen worden om de invloed van het CFTR-genotype op epitheliaal bicarbonaat- en chloridetransport en de respons op CFTR-modulatortherapie te beoordelen.

Deel II Alvleesklierbuis modellen voor het bestuderen van CFTR-functie
De functie van CFTR in humane alvleesklierbuizen van mensen met CF is nauwelijks onderzocht, voornamelijk door een gebrek aan geschikte in vitro- of in vivo-bioassays. Daarom hebben we in het tweede deel van dit proefschrift o.a. een organoïd modelsysteem ontworpen op basis van weefsel gewonnen uit de alvleesklierbuis voor het uitvoeren van CFTR-assays.

Om de buis tijdens alvleesklierontsteking te modelleren, maakten wij eerst organoïden van varkensalvleesklier en gebruikten deze om het effect van ontsteking op CFTR-afhankelijk aniontransport in de buizen te beoordelen (hoofdstuk 6). Onze resultaten wijzen erop dat bepaalde cytokinen, belangrijke mediatoren van de alvleesklier ontstekingsrespons, de expressie van CFTR in buis epitheel sterk verhoogden en CFTR-gemedieerde buis anionsecretie stimuleerden. Zoals ook bij andere epithelia (bijvoorbeeld de luchtwegen) is waargenomen, vereiste inductie van CFTR een combinatie van pro-inflammatoire cytokinen. Stimulatie van CFTR-activiteit kan, door de secretoire capaciteit van het buis epitheel te vergroten, de effecten van externe (metabole) stressfactoren in de buizen verminderen, verdere weefselschade beperken en de ontstekingsrespons in de vroege fasen van alvleesklierontsteking afremmen of voorkomen. Deze resultaten wijzen op een centralere rol van het alvleesklierbuis compartiment, en in het bijzonder van CFTR, in de etiologie van alvleesklierontsteking.

Alvleesklierontsteking kan niet alleen samenhangen met CFTR-mutaties, maar ook het gevolg zijn van omgevingsfactoren die de functie van (wildtype) CFTR verminderen. Wij gebruikten het organoïd model om de hypothese te testen dat ethanol en/of onverzadigde vetzuren invloed hebben op CFTR-functie in de buis (hoofdstuk 7). We vonden dat ethanol en onverzadigde vetzuren slechts marginale effecten hadden op de levensvatbaarheid van buiscellen, en dat zelfs langdurige blootstelling CFTR-gemedieerde anionsecretie niet verminderde. Dit pleit tegen een directe rol voor verworven CFTR-disfunctie in de etiologie van alcohol gerelateerde alvleesklierontsteking.

Om CFTR-functie in de alvleesklier bij patiënten met alvleesklierontsteking te beoordelen, hebben we een methode ontworpen om buis organoïden te verkrijgen uit patiëntmateriaal (hoofdstuk 8). Weefsel werd verzameld via per-orale pancreatoscopie uit de hoofd alvleesklierbuis met behulp van een biopsietang, wanneer patiënten met calcificerende chronische alvleesklierontsteking elektrohydraulische steenvergruizing ondergingen. Wij vonden dat dergelijke weefselmonsters geschikt waren voor de kweek van buis epitheelcellen. Belangrijk is dat deze organoïd modellen CFTR-afhankelijk anion- en vloeistoftransport vertoonden, en dat CFTR-modulatoren in één van deze gevallen de buis anion- en vloeistofsecretie verbeterden. Daarom stellen wij voor dat dit model gebruikt kan worden voor medicatietesten, met als uiteindelijk doel de behandeling van chronische alvleesklierontsteking te verbeteren.