Sophia Muller

Nodulatie is een symbiotische interactie tussen bodembewonende bacteriën, de rhizobia, en vlinderbloemigen zoals het modelorganisme Medicago truncatula. In deze symbiose fixeren rhizobia atmosferische stikstof (N₂) in een voor de plant bruikbare vorm, terwijl de plant in ruil daarvoor koolstofbronnen, zoals suikers, en een beschermde omgeving, het wortelknolletje, verschaft. Dit hoogcomplexe proces is van groot belang, zowel vanwege het landbouwkundig potentieel als vanwege het unieke ontwikkelingsprogramma, dat bij de meeste planten ontbreekt.

Dit proefschrift onderzoekt de ruimtelijk-tijdelijke regulatie van de vroege ontwikkeling van wortelknolletjes in Medicago truncatula, met een focus op hormonale regulatie en het gebruik van transcriptomics met hoge resolutie. Hoofdstuk 1 introduceert de nodulatie bij vlinderbloemigen op algemeen niveau, met nadruk op de hormoonbiologie, en beschrijft waarom inzicht in wanneer en waar wortelcellen van identiteit veranderen essentieel is voor het begrijpen van knolinitiatie. Daarnaast worden huidige kennislacunes in de hormonale regulatie tijdens de vroege symbiose besproken, wat de noodzaak van ruimtelijk-tijdelijk opgeloste benaderingen onderstreept.

In Hoofdstuk 2 wordt onderzocht hoe auxinegradiënten tot stand komen tijdens de vroegste stadia van de wortelknolvorming. Hoewel auxinemaxima al lange tijd in verband worden gebracht met orgaanontwikkeling, waren de mechanismen die deze patronen tijdens nodulatie bepalen tot nu toe onduidelijk. Door DR5-auxinesignalering te correleren met de expressie van genen betrokken bij auxinebiosynthese en -transport, blijkt dat specifieke MtYUCs, MtPINs en MtLAX2 direct na rhizobiale inoculatie in de pericykel worden geactiveerd, voorafgaand aan celdeling. Verder wordt aangetoond dat een nauw gereguleerde auxinebiosynthese en polair auxinetransport noodzakelijk zijn voor de initiatie van het wortelknolprimordium en meristeem. Hoofdstuk 3 breidt deze analyse uit naar ethyleen, een negatieve regulator van nodulatie waarvan de ruimtelijke dynamiek tot dusver niet bekend was. Transcriptomics, synthetische reporters en mutantanalyse tonen aan dat ethyleensignalering na rhizobiale inoculatie sterk wordt hergeprogrammeerd. De ethyleenrespons, gedetecteerd met de EBSn-reporter, verschuift van de binnenste wortelweefsels naar de buitenste cortex en epidermis. Deze verschuiving gaat samen met inductie van MtACS3 en repressie van MtACS10. Waar MtACS10 de knolinitiatie beperkt, reguleert MtACS3 de voortgang van infectiedraden en voorkomt het overmatige of verkeerd gepositioneerde primordia, wat het belang van ruimtelijk begrensde ethyleenregulatie aantoont.

Om vroege nodulatieprocessen met hogere resolutie te bestuderen, worden in Hoofdstuk 4 single-cell- en single-nucleus-RNA-seq-workflows voor wortels en wortelknolletjes ontwikkeld en geoptimaliseerd. Vergelijking van verschillende isolatieprotocollen en high-throughputplatforms identificeert cruciale factoren die RNA-kwaliteit, celviabiliteit en transcriptomdekking beïnvloeden. Geoptimaliseerde protoplast-gebaseerde benaderingen leveren hogere mappingpercentages en een bredere representatie van celtypen, terwijl integratie met nucleus-gebaseerde methoden toegang biedt tot aanvullende informatie en ondervertegenwoordigde populaties. Op basis van deze geoptimaliseerde benaderingen identificeert Hoofdstuk 5 transcriptiefactoren die mogelijk bijdragen aan pericykelcompetentie tijdens wortelknolinitiatie. Integratie van bulk time-course RNA-seq met een single-cell wortelatlas brengt ~600 pericykel-verrijkte, nodulatie-responsieve genen aan het licht en leidt tot een focus op drie transcriptiefactoren—MtbZIP43, MtDREB3 en MtSCL14. Deze genen vertonen onderscheidende maar overlappende expressiepatronen in de pericykel en het vaatweefsel en worden dynamisch geïnduceerd na inoculatie. RNA-interferentielijnen vertonen geen uitgesproken fenotypen, terwijl overexpressie resulteert in een verminderd aantal wortelknolletjes.

Ten slotte plaatst Hoofdstuk 6 deze bevindingen in een breder kader en laat zien hoe de gecombineerde hormonale, transcriptionele en methodologische inzichten bijdragen aan een beter begrip van de ruimtelijke regulatie van symbiotische organogenese.