Valerie van Ingen Buijs

Citrusvlekkenziekte (Citrus Black Spot), veroorzaakt door de schimmel Phyllosticta citricarpa, leidt tot aanzienlijke economische verliezen in de wereldwijde citrusproductie. Dit proefschrift presenteert een uitgebreid onderzoek naar soorten van het schimmelgeslacht Phyllosticta die citrus koloniseren. Via vier experimentele hoofdstukken behandelt het koolstofgebruik, genomische verschillen gerelateerd aan variaties in levensstijl, CRISPR/Cas9-toepassingen en taxonomie.

Na een algemene inleiding in hoofdstuk 1, onderzoekt hoofdstuk 2 de profielen van koolstofgebruik bij verschillende Phyllosticta-soorten, waarbij een hoge mate van gelijkenis werd gevonden, ongeacht een pathogene of endofytische levensstijl. Een opmerkelijke bevinding is de selectieve remming van pathogene soorten door suikerbietpulp (SBP) bij lage concentraties (0,25%), zelfs wanneer dit gemengd is met andere substraten zoals tarwezemelen. Dit effect, dat afwezig is bij niet-pathogenen, suggereert het potentieel van SBP als een duurzaam biologisch bestrijdingsmiddel. De specifieke remmende verbinding die verantwoordelijk is voor dit effect is echter nog niet geïdentificeerd. Daarnaast hebben we de CAZyme-repertoires van soorten met verschillende levensstijlen beoordeeld, maar vonden we slechts weinig variatie.

Hoofdstuk 3 verkent de genomische verschillen tussen pathogenen en endofyten, waarbij kleine variaties in genaantallen, uitgescheiden eiwitten en effectoren werden geïdentificeerd. We vonden verschillende genomische verschillen tussen soorten met verschillende levensstijlen, waarbij niet-geannoteerde pathogeen-specifieke orthogroepen interessante doelwitten vormen voor toekomstig onderzoek naar virulentie. We classificeerden Phyllosticta citrichinaensis als een soort met een tussenliggende levensstijl, aangezien het genomische en fenotypische kenmerken deelt met zowel pathogenen als endofyten. We gebruikten ook CATAstrophy om CAZyme-profielen van 116 Dothideomycetes-genomen op te helderen, en vonden geen duidelijke correlatie tussen het CAZyme-repertoire en de in de literatuur gerapporteerde levensstijl.

Hoofdstuk 4 ontwikkelt een 'proof-of-principle' CRISPR/Cas9-protocol voor Phyllosticta via protoplasting en PEG-gemedieerde transformatie. We hebben het pH-modulatiegen palH uitgeschakeld, dat goed is beschreven in verschillende schimmels en waarvan bekend is dat het een rol speelt bij pathogeniteit. We namen een verminderde groeisnelheid waar in ΔpalH knockout-mutanten, maar vonden geen verschil in pH-modulatievermogen. Deze tool biedt de basis om pathogeniteitsgenen in Phyllosticta effectief te bestuderen, hoewel verfijningen de efficiëntie zouden kunnen verbeteren.

Hoofdstuk 5 beslecht het taxonomische debat over P. citricarpa en P. paracitricarpa. Via fylogenomische analyses met gebruik van 3.000 'single-copy ortholog' genen en volledige genoomvergelijkingen, hebben we vastgesteld dat de verschillen tussen P. citricarpa en P. paracitricarpa variatie binnen de soort P. citricarpa vormen (infraspecifieke variatie). Verder hebben we de variatie in mitochondriale genoomassemblages van meerdere Phyllosticta-soorten beoordeeld en vonden we slechts minimale verschillen tussen de assemblages van P. citricarpa en P. paracitricarpa. Samen met het feit dat morfologische kenmerken overlappen, geven deze gegevens aan dat deze soorten als synoniemen moeten worden behandeld.

De discussie (Hoofdstuk 6) evalueert de voorgaande hoofdstukken, benoemt uitdagingen bij de classificatie van levensstijlen en debatteert over 'DNA-only' typebeschrijvingen. In het algemeen bevordert dit proefschrift ons begrip van Phyllosticta door genomische verschillen tussen levensstijlen bloot te leggen, CRISPR-instrumenten te presenteren en het taxonomische debat over P. citricarpa/P. paracitricarpa op te lossen, wat de weg vrijmaakt voor verfijnde ziektebestrijdingsstrategieën.